生物技术概论

一、生物技术的定义生物技术（biotechnology），有时也称生物工程（bioengineering），是指人们以现代生命科学为基础,结合其他基础学科的科学原理，采用先进的工程技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。因此，生物技术是一门新兴的、综合性的学科。先进的工程技术手段是指基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程等新技术。改造生物体是指获得优良品质的动物、植物或微生物品系。生物原料则指生物体的某一部分或生物生长过程所能利用的物质，如淀粉、糖蜜、纤维素等有机物，也包括一些无机化学品，甚至某些矿石。为人类生产出所需的产品包括粮食、医药、食品、化工原料、能源、金属等各种产品。达到某种目的则包括疾病的预防、诊断与治疗、环境污染的检测和治理等。二、生物技术的研究内容根据生物技术操作的对象及操作技术的不同，生物技术主要包括以下5项技术（工程）。（1）基因工程基因工程（geneengineering）是应用人工方法把生物的遗传物质（DNA）分离出来，在体外进行切割、拼接和重组。然后将重组了的DNA导入某种宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传品性;有时还使新的遗传信息（基因）在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物（多肽或蛋白质）。这种创造新生物并给予新生物以特殊功能的过程就称为基因工程，也称为DNA重组技术。（2）细胞工程细胞工程（cellengineering）是指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动、植物个体，或获得某种有用的物质的过程。细胞工程应包括动、植物细胞的体外培养技术、细胞融合技术（也称细胞杂交技术)、细胞器移植技术等。（3）发酵工程发酵工程（fermentationengineering）是利用微生物生长速度快、生长条件简单以及代谢过程特殊等特点，在合适条件下通过现代化工程技术手段，由微生物的某种特定功能生产出人类所需的产品称为发酵工程,有时也称微生物工程。（4）酶工程酶工程（enzymeengineering）是利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能，或对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术。它包括酶的固定化技术、细胞的固定化技术、酶的修饰改造技术及酶反应器的设计等技术。（5）蛋白质工程蛋白质工程（proteinengineering）是指在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，从而达到对蛋白质进行修饰、改造、拼接以产生能满足人类需要的新型蛋白质。一、改善农业生产、解决食品短缺（1）提高农作物产量及其品质1、培育抗逆的作物优良品系通过基因工程技术对生物进行基因转移，使生物体获得新的优良品性，称之为转基因技术。利用转基因技术可以培育出具有抗寒、抗旱、抗盐、抗病虫害等抗逆特性及品质优良的作物新品系，如转苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis，Bt）毒蛋白基因的抗虫棉花。2、植物种苗的工厂化生产利用细胞工程技术对优良品种进行大量的快速无性繁殖，实现工业化生产，即植物微繁殖技术，又称植物微繁殖技术。利用这种无性繁殖技术，可在短时间内得到遗传稳定的、大量的小苗（试管苗），并可实现工厂化生产。利用植物微繁殖技术还可培育出不带病毒的脱毒苗。植物的微繁殖技术已广泛地应用于花卉、果树、蔬菜、药用植物和农作物的快速繁殖。3、提高粮食品质生物技术除了可培育高产、抗逆、抗病虫害的新品系外，还可培育品质好、营养价值高的作物新品系。例如，科学家将水仙花和玉米合成β-胡萝卜素的基因导入水稻培育出高β-胡萝卜素含量的水稻（GoldenRice，黄金稻）（图1-1）。图1-1黄金稻a：普通水稻；b：转水仙花β-胡萝卜素合成基因水稻；c：转玉米β-胡萝卜素合成基因水稻4、生物固氮，减少化肥使用量现代农业均以化学肥料，如尿素、硫酸铵作为氮肥的主要来源。化肥的使用不可避免地带来了土地的板结，肥力的下降；化肥的生产又将导致环境的污染。科学家们正努力将具有固氮能力的细菌的固氮基因转移到作物根际周围的微生物体内，希望由这些微生物进行生物固氮，减少化肥的使用量。5、生物农药，生产绿色食品近年来，人们越来越注意农业生产的可持续发展及人与环境的协调，特别是由于化学农药的毒性作用及筛选新农药的艰难，企业和研究人员开始把注意力转向生物农药的研究开发与使用。因其不污染环境，对人和动植物安全，不伤害天敌，所以发展生物农药已成为保障人类健康和农业可持续发展的重要趋势。（2）发展畜牧业生产1、动物的大量快速无性繁殖1997年2月英国Roslin研究所的Wilmut等在《Nature》杂志上刊登了用绵羊乳腺细胞培育出“多莉”（图1-2）。证明动物体细胞也具有全能性，同样有可能进行动物的大量、快速无性繁殖。图1-2“多莉”及其代孕母亲（苏格兰黑面绵羊）二、培育动物的优良品系利用转基因技术，将与动物优良品质有关的基因转移到动物体内，使动物获得新的品质。1983年美国学者将大鼠的生长激素基因导入小鼠获得转基因小鼠。除了小鼠外，科学家们已成功地培育了转基因羊、转基因兔、转基因猪、转基因鱼等多种动物新品系。2、提高生命质量，延长人类寿命（1）开发制造奇特而又贵重的新型药品1977年，美国首先采用大肠杆菌生产了人类第一个基因工程药物—人生长激素释放抑制激素。利用基因工程生产的药物，除了人生长激素释放抑制激素外，还有人胰岛素、人生长激素、人干扰素等。（2）疾病的预防和诊断传统的疫苗生产方法对某些疫苗的生产和使用，存在着免疫效果不够理想、被免疫者有被感染的风险等不足。利用基因工程生产重组疫苗可以达到安全、高效的目的。如已经上市或已进入临床试验的病毒性肝炎疫苗；肠道传染病疫苗（包括霍乱、痢疾等）等。利用细胞工程技术可以生产单克隆抗体。单克隆抗体既可用于疾病治疗，又可用于疾病的诊断。利用基因工程技术还可生产诊断用的DNA试剂。（3）基因治疗导入正常的基因来治疗由于基因缺陷而引起的疾病，一直是人们长期以来追求的目标。1990年，美国FDA批准了用ADA(腺苷脱氨酶基因)基因治疗严重联合型免疫缺陷病，并取得了较满意的结果。三、解决能源危机、治理环境污染（1）解决能源危机生物能源将是最有希望的新能源之一，而其中又以乙醇最有希望成为新的替代能源。科学家们希望找到一种可以利用大量的农业废弃物如杂草、木屑、植物的秸杆等纤维素或木质素类物质或其他工业废弃物作的微生物。通过微生物发酵或固定化酶技术，将农业或工业的废弃物变成沼气或氢气。（2）环境保护传统的化学工业生产过程大多在高温高压下进行，是一个典型的耗能过程并带来环境的严重恶化。如果改用生物技术方法来生产，不仅可以节约能源还可以避免环境污染。例如用化学方法生产农药，不仅耗能而且严重污染环境，如改用苏云金杆菌生产毒性蛋白，即可节约能源而且该蛋白质对人体无毒。四、制造工业原料、生产贵重金属（1）制造工业原料利用微生物在生长过程中积累的代谢产物，生产食品工业原料，种类繁多。概括起来，主要有以下几个大类：①氨基酸类，主要有谷氨酸(即味精)、赖氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、缬氨酸等；②酸味剂，主要有柠檬酸、乳酸、苹果酸、维生素C等；③甜味剂，主要有高果糖浆、天冬甜精、氯化砂糖。发酵技术还可用来生产化学工业原料。主要有传统的通用型化工原料如乙醇、丙酮、丁醇等产品。（2）生产贵重金属一、基因工程的定义在漫长的生物进化过程中，基因重组从来没有停止过。在自然力量及人类干扰下，通过基因重组、基因突变和基因转移等途径，生物界无止境地进化,，不断使物种趋向完善,出现了今天各具特性的繁多物种。有的能忍耐高温，有的不怕严寒，有的能适应干旱的沙漠，有的可在高盐度的海滩上或海水中生繁，有的能固定大气中的氮素⋯⋯种种生物的特殊性状成为今天定向改造生物、创造新物种的丰富遗传资源。但是没有一种生物是完美无缺的，因此，有待科技工作者有目的地去进一步改造。按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物特性，在较短的时间内使现有物种的性能得到改善，创造出更符合人们需要的新的生物类型，或者利用这种技术对人类疾病进行基因治疗，这就是基因工程。基因工程最突出的优点是打破常规育种难以突破的物种之间的界限，可以使原核生物与真核生物之间，动物与植物之间，甚至人与其他生物之间的遗传信息进行相互重组和转移。在冶金工业方面，面对数量庞大的废渣矿、贫矿、尾矿、废矿，采用一般的采矿技术已无能为力，惟有利用细菌的浸矿技术才能对这类矿石进行提炼。可浸提的金属包括金、银、铜、铀、锰、钼、锌、钴、镍、钡、铊等10多种贵重金属和稀有金属。1、基因工程研究的理论依据（1）不同基因具有相同的物质基础地球上几乎所有的生物，从细菌到高等动物和植物直至人类，它们的基因都是一个具有遗传信息的DNA片段。所有生物的DNA的组成和基本结构都是一样的。因此，不同生物的基因（DNA片段）原则上是可以重组互换的。虽然有些病毒的基因是RNA，但这些病毒的RNA仍可以通过反转录产生cDNA（complementaryDNA，互补DNA），并不影响不同基因之间的重组。（2）基因是可以切割的基因直线排列在DNA上。除少数基因重叠排列外，大多数基因彼此之间存在着间隔序列。因此，作为DNA分子上一个特定核苷酸序列的基因，允许从DNA分子上一个一个完整地切割下来。（3）基因是可以转移的基因不仅是可以切割下来的，而且携带基因的DNA分子可以在不同生物之间转移，或者在生物体内的染色体上迁移，甚至可以在不同染色体间跳跃，插入到靶DNA分子中。由此表明，基因是可以转移的，而且是可以重组的。转移后的基因一般仍有功能。（4）多肽与基因之间存在对应关系普遍认为，一种多肽就有一个相对应的基因。因此，基因的转移或重组最终可以根据其表达产物多肽的性质来考察。（5）遗传密码是通用的所有生物从低等的病毒直至人类，蛋白质合成都使用同一套遗传密码，只有少数例外，也就是说遗传密码是通用的。重组的DNA分子不管导入什么样的生物细胞中，只要具备转录翻译的条件，其上面的遗传密码均能转录翻译出相应的氨基酸。即使人工合成的DNA分子（基因），其上面的遗传密码同样可以转录翻译出相应的氨基酸。（6）基因可以通过复制把遗传信息传给下一代经重组的基因在合适条件下是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生物。3、基因工程操作的基本技术路线基因工程是一项比较复杂的技术，如果抛开细节问题，基因工程操作的基本技术路线如图2-1所示。图2-1基因工程的基本技术路线以上技术路线概括为4个步骤：①获得目的基因；②构建克隆载体；③目的基因与克隆载体重组后导入受体细胞；③获得克隆子；④对克隆子中目的基因进行检测和鉴定。一、DNA的组成与结构（1）DNA的组成DNA是一类由4种脱氧核苷酸按照一定的顺序聚合而成的大分子。脱氧核苷酸分子由脱氧核糖、磷酸和碱基组成。脱氧核糖的第一位碳原子(1')上连接一个碱基，第5位碳原子(5')上连接一个磷酸基团，组成一个脱氧核苷酸。一个脱氧核苷酸的脱氧核糖的5'磷酸基团和另一个脱氧核苷酸的脱氧核糖的3'羟基结合形成磷酸二酯键,把两个脱氧核苷酸连接在一起。多个脱氧核苷酸按此方式连接成多聚脱氧核苷酸,其一端为游离的5'磷酸基团（5'-P），称为5'端，而另一端为游离的3'羟基（3'-OH），称为3'端（图2-1）。如果连接成的多聚脱氧核苷酸是环状的，则无游离的'端和3'端。图2-1DNA的一段多聚脱氧核苷酸链组成DNA的碱基有腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）4种，分别含有这4种碱基的脱氧核苷酸依次称为腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸。多聚脱氧核苷酸链中，各种脱氧核苷酸的脱氧和糖和磷酸的结构和位置是一致的，不同的只是碱基，因此多聚脱氧核苷酸链（DNA链）中的脱氧核苷酸可以用碱基来表示。例如5'端开始依次由脱氧鸟苷酸、脱氧胞苷酸、脱氧胞苷酸、脱氧腺苷酸、脱氧胸苷酸连接成的多聚脱氧核苷酸片段可用碱基5'-GCCAT-3'表示。（2）DNA的结构DNA通常以双链形式存在。两条脱氧核苷酸链总是按碱基A与T、G与C互补配对，通过氢键形成稳定的双螺旋结构，称为双链DNA(图2-2)。绝大部分生物细胞中的DNA都是双链，只有少数病毒（噬菌体）中的DNA以单链形式存在。图2-2DNA双链示意图二、DNA的功能（1）DNA分子能在细胞内复制DNA的功能之一是在细胞内能够进行半保留复制。复制后，新产生的双链DNA分子中含有一条旧链和一条新链，使DNA携带的信息可以精确传递。（2）携带遗传信息DNA是生物界遗传信息的主要携带者，DNA上的部分核苷酸序列决定着RNA的核苷酸序列。通过转录，这些核苷酸序列分别指令转录出核糖体RNA（rRNA）、转移RNA（tRNA)和信使RNA(mRNA）。rRNA是核糖体的一部分；tRNA在蛋白质合成过程中转运氨基酸；mRNA上的核苷酸序列编码蛋白质的氨基酸序列，经过翻译把遗传信息进一步传递给蛋白质（多肽）。基因应包括转录启动子的序列和转录区的序列。在转录过程中，构成启动子的序列不转录出相应的RNA序列，只有转录区的序列才转录出相应的RNA序列。一个基因或一个操纵子能否有效转录，首先取决于其上游是否存在有效的启动子。启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点。转录区从转录的起始位点开始，包括基因编码区和转录终止子。基因编码区指转录mRNA上起始密码AUG（少数为GUG）至终止密码UAG（UAA、UGA）的各种遗传密码的核苷酸序列。原核生物的转录区有的是由2个或2个以上基因组成的操纵子。组成同一操纵子的所有基因共用一个启动子，但是每个基因的编码区都含有起始密码序列和终止子序列，两个基因编码区之间往往含有非编码的间隔序列。真核生物的转录区，一个启动子只控制转录一个基因的编码区，但编码区内除了各种编码序列以外，往往含有一个或几个长度不同的非编码间隔序列区，称为内含子（intron）。被内含子分隔的编码序列，称为外显子（exon）。在基因编码区下游有一段使转录终止的核苷酸序列，称为转录终止子（terminator）。一个操纵子虽然由多个基因组成，但与启动子一样也只需要一个终止子。一、限制性核内切酸酶和DNA片段化（1）限制性核内切酸酶限制性内切核酸酶(restrictionendo-endonuclease)能识别双链DNA中特定核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具5′-磷酸基（-P）基和3′-羟基（-OH）的DNA片段的内切脱氧核苷酸酶(endo-deoxyribonuclease)。至今发现的限制性内切核酸酶有Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。基因工程操作中真正有用的是Ⅱ型酶。如果没有专门说明，通常所说的限制性内切酶就是Ⅱ型酶。（2）限制性核内切酸酶的识别序列限制性内切核酸酶在双链DNA分子上能识别的特定核苷酸序列称之识别序列。各种限制性内切核酸酶都有相应的识别序列。如，限制性内切核酸酶EcoRI的识别序列为GAATTC。有一些限制性内切核酸酶虽来源不同，但有相同的识别序列，这样的限制性内切核酸酶称为之同裂酶，如BamHI和BstI具有相同的识别序列GGATCC。（3）限制性内切核酸酶的酶切位点DNA在限制性内切核酸酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二脂键断开的位置被称为酶切位点，用↓表示。限制性内切核酸酶在DNA上的酶切位点一般是在识别序列内部，如G↓GATCC。DNA分子经限制性内切核酸酶酶切产生的末端因所用的酶不同而不同。两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键端开的位置如果是交错的，产生的DNA片段末端的一条链多出1至几个核苷酸，这样的末端称为粘性末端。DNA片段末端5′端比3′端长的称为5′粘性末端,3′端比5′端长的称为3′粘性末端。如果两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断裂后产生的DNA片段末端是平齐的,称为平末端。不管是粘性末端还是平末端,5′端一定是-P基团，3′端一定是OH基团。有些限制性内切核酸酶虽然识别序列不同，但酶切DNA分子产生的DNA片段具有相同的粘性末端，这样的一组限制性内切核酸酶称为同尾酶。二、特异性DNA片段的PCR扩增1983年体外扩增DNA片段的方法产生，即聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)。采用这种方法，在反应系统中只要有一个待扩增的DNA拷贝，在短时间内就能扩增出大量拷贝数的待扩增DNA片段，可满足用于常规方法的DNA检测和DNA重组。（1）PCR基本原理PCR是模仿细胞内发生的DNA复制过程进行的，以DNA互补链聚合反应为基础，通过靶DNA变性、引物与模板DNA(待扩增DNA)一侧的互补序列复性、耐热性DNA聚合酶催化引物延伸等过程的多次循环，产生待扩增的特异性DNA片段。一般反应过程是：①反应系统加热至90-95℃，双链DNA变性成为两条单链DNA（变性），作为互补链聚合反应的模板；②降温至37-60℃，使两种引物分别与模板DNA链链的3′一侧的互补序列杂交(复性或退火)；③升温至70-75℃，耐热性DNA聚合酶催化引物按5'→3'方向延伸合成模板DNA链的互补链（延伸）。重复以上过程，经过25-30次循环，就可以出现随待扩增的特异性DNA片段(图2-3)。图2-3PCR扩增特异性PCR片段过程（2）耐热性DNA聚合酶耐热性DNA聚合酶的发现，使PCR扩增特异性DNA片段成为可能。由于这种酶在靶DNA变性的高温下仍保持活性，因此在PCR扩增特异性DNA片段的全过程中，只需一次加入反应系统中，不必在每次高温变性处理后再添加酶。目前用于PCR的耐热性DNA聚合酶主要有：TaqDNA聚合、Pwo酶等。（3）PCR引物PCR引物是PCR过程中与模板DNA部分序列互补，并能引导模板DNA互补链合成的一种脱氧核苷酸寡聚体，其3′端必须具有游离的-OH。引物按预先设计用化学方法合成，其长短与PCR过程的特异性高低密切相关。一般来说，引物越长，特异性越高。为扩增特异性高的DNA片段，一般设计的引物由20-30核苷酸组成。三、DNA片段的化学合成（1）合成引物除上述的PCR引物外，常用的还有核苷酸序列测序引物及合城cDNA的引物等。（2）合成DNA寡聚核苷酸连杆寡聚核苷酸连杆(linker)是一种按预先设计，化学合成的寡核苷酸片段。寡聚核苷酸连杆一般由8-12个核苷酸组成，以中线为轴两侧互补对称。其上有一种或几种限制性内切核酸酶的识别序列，使连接了寡聚核苷酸连杆的DNA片段经过这些限制性内切核酸酶酶切后，可以产生一定的粘性末端，便于与具有相同粘性末端的另一DNA片段连接。如果连杆的两端已具有一种或两种限制性内切核酸酶酶切产生的粘性末端，可直接使两DNA片段连接，也称为衔接头或接头（adaptor）。（3）合成基因片段根据某基因测定的核苷酸序列，或者根据蛋白质氨基酸序列推导的核苷酸序列，可以用DNA自动合成议化学合成相应的基因片段。一、DNA连接酶DNA连接酶（DNAligase）能催化双链DNA片段紧靠在一起的3′-OH与5′-P之间形成磷酸二酯键（图2-4）。DNA连接酶主要有大肠杆菌（E.coli）DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。E.coliDNA连接酶只能催化双链DNA片段互补粘性末端之间的链接；T4DNA连接酶既可以用于双链DNA片段互补粘性末端之间的链接，也可催化双链DNA片段平末端之间的链接，但平末端之间链接的效率比较低。图2-4DNA连接反应示意图二、DNA片段之间的链接（1）互补粘性末端片段之间的链接链接反应一般可用E.coliDNA连接酶，也可以用T4DNA连接酶（图2-5）。待连接的两个DNA片段如果是同一限制性内切核酸酶酶切的，连接后仍保留原限制性内切核酸酶的识别序列。如果用两种同尾酶酶切的，虽然产生相同的互补粘性末端，可以进行有效的连接，但获得的重组DNA分子往往缺少了原来用于酶切的那两种限制性内切核酸酶的识别序列。图2-5互补粘性末端片段之间的链接（2）平末端DNA片段之间的链接链接反应需用T4DNA连接酶。只要两个DNA片段是平齐的，不管是用限制性内切核酸酶酶切产生的，还是其他方法产生的，都可以进行连接（图2-6）。如果在两种不同限制性内切核酸酶酶切后产生的平齐末端DNA片段之间进行连接，连接后的DNA分子失去了那两种限制性内切核酸酶的识别序列。如果两个DNA片段的末端是用同一限制性内切核酸酶酶切产生的，连接后的DNA分子仍保留那种酶的识别序列，有的还出现另一种新的限制性内切酶的识别序列。图2-5平齐末端片段之间的链接三、DNA片段修饰后的链接待连接的两个DNA片段经过不同限制性内切核酸酶酶切后，产生的末端不是互补的粘性末端，或者一个是粘性末端另一个是平末端。在这种情况下，链接之前必须对两个末端或一个末端进行修饰。修饰的方式主要是采用外切核酸酶将粘性末端修饰成平末端；采用末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）将平末端修饰成互补粘性末端；采用DNA聚合酶将粘性末端修饰成平末端。有时为了避免待连接的两个DNA片段自行连接成环形DNA，或自行连接成二聚体，可采用碱性磷酸酶使其中一个DNA片段5′端-P修饰成-OH，即去磷酸化。4、DNA片段加连杆或接头后连接如果要连接既不具互补粘性末端又不具平末端的两种DNA片段，除了用修饰一种或两种DNA片段末端后进行连接的方法外，还可以采用人工合成连杆或接头。先将连杆连接到待连接的一种或两种DNA片段末端，然后用合适的限制性内切酶酶切连杆，使待连接的两种DNA片段具互补粘性末端，最后在DNA连接酶崔化下使两种DNA片段连接，产生重组DNA分子。若在DNA片段末端加的是接头，不需利用限制性内切酶酶切。一、克隆载体在转基因研究中，单独一个包括启动子、编码区和终止子的基因，或者组成基因的某个元件，一般不容易进入受体细胞，即使采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体内稳定维持。把能够承载外源基因，并将其带入受体细胞得以稳定维持的DNA分子称为基因克隆载体(genecloningvector)。作为基因克隆载体一般应该具备以下条件：①在克隆载体合适的位置必须含有外源DNA片段组入的多克隆位点（multiplecloningsite），对于某种克隆位点来说，在载体上一般只有一个。②一般能在携带外源DNA（基因）进入受体细胞后，或停留在细胞质中进行自我复制；或整合到染色体DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA，随这些DNA的复制而同步复制；或自成染色体同其他染色体一样自行复制。③必须含有供选择转化子的标记基因或报告基因。④必须是安全的，不含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除选定的受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞。基因克隆载体示意图二、基因工程常用质粒载体质粒（plasmid）是一种存在于宿主细胞中染色体外的裸露DNA分子，一个质粒就是一个DNA分子。质粒含有复制起始位点，能在宿主细胞内进行自主复制，但不会像某些病毒那样进行无限制的复制，导致宿主细胞的崩溃。每个质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝数，少数几个，多者上百。质粒DNA分子小的不足2kb,大的可达100kb以上，多数10个kb左右。（1）大肠杆菌质粒载体大肠杆菌质粒载体是一类应用广泛的克隆载体，含有大肠杆菌源质粒的复制起始位点，能够在转化的大肠杆菌中进行复制。1）pBR322质粒载体pBR322是一种典型的常用质粒载体。pBR322由大肠杆菌源质粒ColE1衍生的质粒pMB1为基础构建而成，含有ColE1的复制起始位点（Col-ori）,能在大肠杆菌细胞中进行高拷贝复制。含有选择标记基因Ampr和Tetr。Ampr基因区的PstⅠ和PvuⅠ的识别位点，Tetr基因区的ClaⅠ、HindⅢ、BamHⅠ和SalⅠ等的识别位点是常用的克隆位点。pBR322分子大小为4363bp，可以克隆10kb以下的外源DNA片段。质粒载体pBR3222）pUC18/19质粒载体pUC18/19质粒载体具有pBR322的复制起始位点，含有选择标记基因Ampr和lacZ′,并在lacZ′区组装了多克隆位点(MCS)连杆,外源DNA片段插入MCS的任一克隆位点后，导致lacZ′基因失活，可提供菌落蓝/白选择标记，并且插入MCS的外源基因可以在lac启动子调控下进行表达。pUC18与pUC19的差别只是MCS连杆上的克隆位点以相反的方向排列。pUC18/19质粒载体（2）农杆菌Ti质粒载体根癌农杆菌含有一种内源质粒，当农杆菌同植物接触时会引发植物产生肿瘤（冠瘿瘤），因次称此质粒为Ti质粒（tumorinducingplasmid）。根癌农杆菌引发植物产生肿瘤Ti质粒是一种双链环状DNA分子，其大小为200kb，但是能进入植物细胞的只是一小部分，约25kb，称为T-DNA（transferDNA）。T-DNA左右两边界(LB，RB)各有一个选择标记基因25bp的正向重复序列(LTS和RTS)，对T-DNA的转移和整合是不可缺少的，并且己证实T-DNA只要保留两端边界序列，即使中间的序列不同程度被任何一个外源DNA片段所替换，进入植物细胞后仍可整合到植物基因组中。根据Ti质粒的这个性质，近年来构建成含LB和RB的质粒载体，已被广泛地用于植物的基因转移。Ti质粒克隆载体示意图（3）T克隆载体很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。T克隆载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。T克隆载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到T克隆载体中，形成含有目的片断的重组载体。pBM19-T克隆载体示意图病毒主要由DNA(或RNA)和外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。通过感染，病毒颗粒进入宿主细胞，利用宿主细胞的DNA(或RNA)复制系统和蛋白质合成系统进行DNA(或RNA)的复制和外壳蛋白的合，实现病毒颗粒的增殖。一、噬菌体载体（1）λ噬菌体载体λ噬菌体由DNA(λDNA)和外壳蛋白组成（图a），对大肠杆菌具有很高的感染能力。λDNA在噬菌体中以线状双链DNA分子存在，全长48502bp。其左右两端各有12个核苷酸组成的5'突出粘性末端(cohesiveend)（图b），而且两者核苷酸序列互补，进入宿主细胞后，粘性末端连接成为环状DNA分子，将此末端称为cos位点(cohesiveendsite)。λ噬菌体能包装λDNA原长75%-105%的DNA片段，36.4-51kb，并且λDNA上约有20kb时区域对λ噬菌体的生长不是绝对需要的，可以缺失或被外源DNA片段取代。λ噬菌体示意图构建入噬菌体克隆载体的策略是：①用合适的限制性内切核酸酶切去λDNA上的部分或全部非必需区，相应保留这种酶的1个或2个识别序列和切割位点作为克隆位点，并用点突变或甲基化酶处理等方法使必需区内的这种酶的识别序列失效，避免外源DNA片段插入必需区。②若有必要可在非必需区组入选择标记基因。③构建的λDNA载体不应小于36.4kb。由此构建成λ噬菌体载体。构建λ噬菌体载体的示意图（2）cosmid载体由于λ噬菌体载体本身必须大于36.4kb，限制了允许克隆的外源DNA片段。研究发现只要保留λDNA两端各不少于280bp的片段，并且该片段内含有cos位点及与包装相关的核苷酸序列；当插入外DNA片段后总长大于36.4kb，小于51kb；这样的重组λDNA分子就能进行有效包装和转导受体细胞。根据这一性质构建了cosmid载体。cosmd载体是一种环状双链DNA分子，由质粒DNA和部分λDNA组成。cosmid载体示意图质粒部分含有大肠杆菌源质粒复制起始位点、克隆位点和选择标记基因等基本构件，可以像质粒载体一样承载外源DNA片段，转化大肠杆菌受体细胞，并在其中自行复制和增殖。λDNA部分允许重组λDNA分子进行有效包装和转导受体细胞。但是由于cosmid载体不具λ噬菌体溶菌生长途径，因此不产生子代噬菌体。cosmid载体一般在10kb以下，能承载比较大（40kb左右）的外源DNA片段，被广泛地用于构建基因组文库。二、植物病毒克隆载体植物病毒种类繁多，已用于构建植物载体的有双链DNA病毒花椰菜花斑病毒（CaMV），单链DNA病毒番茄金黄花叶病毒(TGMV)、非洲木木薯花叶病毒(ACMV)、玉米线条病毒(MSV)、小麦矮缩病毒(WDV)，以及大麦条纹花叶病毒(BSMV)、番茄丛矮病毒(TBSV)、马铃薯X病毒(PVX)、烟草花叶病毒(TMV)等。构建植物病毒克隆载体的基本策略是对病毒DNA(包括RNA反转录的DNA)进行加工，消除其对植物的致病性，保留其通过转导或转染能迸入植物细胞的特性，使其携带的目的基因能导入植物细胞。由于植物病毒克隆载体的应用局限性比较大，因此植物病毒载体应用并不普遍。利用CaMV感染植物后能启动35SRNA转录的强启动子，构建含35S启动子的高效表达载体（图2-16），能启动目的基因在植物细胞中进行高效的表达。35S启动子示意图三、动物病毒克隆载体由于动物转基因不能应用质粒克隆载体，因此动物病毒克隆载体在动物转基因研究中起着更重要的作用。目前，用于构建克隆载体的动物病毒有痘苗病毒(poxvirus),腺病毒(adenovirus)、杆状病毒(bacuovrus)、猿猴空泡病毒(simianvacuolatingvirus)和反转录病毒(retrovirus)等。一、人工染色体载体质粒载体、病毒(噬菌体)克隆载体各具优点，但它们能承载的外源DNA片段大小一般不超过50kb。显然这些载体限制了对具有庞大和复杂功能的人和高等动植物基因组的研究。因此，伴随结构基因组学和功能基因组学研究的发展，以及实施人类基因组计划和动植物基因组计划的需要，能承载大片段DNA的人工染色体载体应运而生，并且发展迅速。人工染色体是指能在宿主细胞中稳定地复制并准确传递给子细胞的人工构建的染色体。由于人工染色体能承载100kb以上的DNA大片段，因此又称为大DNA片段克隆载体。目前已构建的人工染色体从其结构来分可分为两类，即线形的人工染色体和环形的人工染色体。线形的人工染色体如同真核生物的染色体一样，必须含有染色体的结构元件端粒(telomere)、着丝粒(centromere)和复制起始区(originofreplication)。端粒对染色体DNA两个末端起封口和保护作用。着丝粒负责染色体向子细胞的传递。复制起始区的功能是负责启动染色体的复制，使构建的人工染色体能在宿主细胞中稳定地复制并准确传递给子细胞。属于这一类的人工染色体有酵母菌人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)、植物人工染色体（plantartificialchromosome,PAC）、人类人工染色体(humanartificialchromosome,HAC)和哺乳动物人工染色体(mammalartificialchromosome,MAC)等。环形的人工染色体则不需要端粒和着丝粒，但必须含有合适的复制起始区，使构建的环形人工染色体能在宿主细胞内稳定地复制，并在细胞分裂过程中分配到子细胞中。属于这一类的人工染色体有细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)、源于噬菌体P1的人工染色体(P1derivedartificialchromosome,PAC)、双元细菌人工染色体（binaryBAC,BI-BAC)、可转化人工染色体(transformationcompetentartificialchromosome,TAC)。不管是哪一类人工染色体，作为DNA片段克隆载体，还必须具备合适的克隆位点和选择标记基因等克隆载体必备的元件。2、基因表达载体作为基因表达载体，在构建的载体中除了一般克隆载体必备的构件外，在插入目的基因的克隆位点上、下游，还应有供目的基因转录mRNA必备的启动子和终止子，与目的基因在受体细胞内的表达强弱密切相关。其中启动子尤为重要，在构建表达载体时常用的启动子有诱导启动子和组织特异性启动子，构建的载体相应称为诱导型表达载体和组织特异性表达载体。（1）诱导型表达载体诱导型表达载体指载体中的启动子必须在特殊的诱导条件下才有转录活性或较高转录活性的表达载体。外源基因处于这样的启动子下，必须在合适的诱导条件下才能表达。采用这种表达载体获得的转基因生物便于人工控制，即使进入自然环境中，由于不存在合适的诱导条件，不能表达外源基因产物，因此不易导致环境污染和影响生态系统的平衡。可以认为这是一类较安全酌基因表达载体。并且鉴于诱导表达载体能人为地控制基因时空的表达，将为基因治疗的临床应用及基础研究提供良好的手段。目前用作诱导型的启动子有二价金属离子诱导启动子、红光诱导启动子、热诱导启动子和干旱诱导启动子，等等。（2）组织特异性表达载体在较高等的真核生物中，有一类特殊的启动子只有在一定的组织中才能调控其下游的基因进行有效的表达。选用这样的启动子可以构建一系列组织特异性表达载体，为研究动植物发育和人类基因治疗等提供有效的手段。目前，已构建的组织特异性表达载体有乳腺组织特异性表达载体、肿瘤细胞特异性表达载体、花药特异性表达载体和种子特异性表达载体。在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因称为目的基因。目的基因一般是结构基因，也就是能转录和翻译出多肽（蛋白质）的基因。一、目的基因的来源目的基因主要来源于各种生物。真核生物染色体基因组，是获得目的基因的主要来源。原核生物的染色体基因组也是目的基因来源的候选者。线粒体基因组、叶绿体基因组，以及质粒基因组和病毒(噬菌体)基因组也可从中获得有特殊需要的目的基因。此外，化学合成的DNA也是目的基因的来源之一。二、分离目的基因的途径根据实验需要，待分离的目的基因可能是一个基因编码区，或者包含启动子和终止子的功能基因；可能是一个完整的操纵子或由几个功能基因、几个操纵子聚集在一起的基因簇；也可能只是一个基因的编码序列，甚至是启动子或终止子等元件。常采用的方法主要有酶切直接分离法、PCR扩增法、构建基因组文库或cDNA文库分离法、化学合成法等。（1）利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离月的基因为了获得己克隆在载体中的目的基因，只要根据目的基因两侧的限制性内切核酸酶识别序列，用适当的限制性内切核酸酶酶切，一次就可获得目的基因，如图2-17所示，用BamHI和EcoRI酶切此质粒，就可获得目的基因。图2-17用限制性内切核酸酶法获得目的基因示意图（2）利用PCR直接扩增目的基因PCR扩增技术己广泛地用于分离目的基因。如果知道目的基因的全序列或其两侧序列，可以通过合成一对与模板DNA互补的引物，十分有效地扩增出含目的基因的DNA片段（图2-18）。图2-18PCR扩增目的基因示意图（3）通过构建基因组文库和cDNA文库分离目的基因1）基因组文库把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存在一个受体菌克隆子群体中，这个群体即为这种生物的基因组文库(图2-19)。若这个群体中只储存某种生物基因组的部分遗传信息，则称为部分基因组文库。用于构建基因组文库的克隆载体有λ噬菌体克隆载体、cosmid克隆载体、BAC克隆载体、BIBAC克隆载体、PAC克隆载体和YAC克隆载体等。图2-19基因组文库构建意图2）cDNA文库某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，储存在一种受体菌克隆子群体之中，这样的群体称为cDNA文库(图2-20)。如果此群体中只储存该基因组的部分cDNA，则称为部分cDNA文库。cDNA文库的一个克隆子包含一个基因的全部编码序列，不含内含子，也不含转录启动子和终止子的核苷酸序列。因此从cDNA文库中获得的目的基因在其两侧必须组装上转录启动子和终止子等元件。用于构建cDNA文库的载体有质粒载体和噬菌体克隆载体。图2-20cDNA文库构建意义图3）从基因组文库或cDNA文库中获得目的基因

构建了某生物的基因组文库或cDNA文库，但是并不等于完成了目的基因的分离，因为文库中究竟哪一个克隆子含有需要的目的基因尚不得而知。因此必须用合适的方法从文库中筛选分离出含有目的基因的特定克隆子。根据目的基因已知核苷酸序列进行筛选分离这是分离目的基因最直接的方法，根据目的基因已知的核苷酸序列制备核酸探针，对基因组文库或cDNA文库的一系列克隆子的DNA分子进行杂交，能杂交的克隆子就含有目的基因(阳性克隆子)（图2-21）。进一步对阳性克隆子重组DNA进行测序，与已知基因的核苷酸序列进行比较和鉴定，确定是否是待分离的目的基因。应用这种方法可以比较方便地获得目的基因，但是获得的基因一般不是新的基因。图2-21利用核酸杂交鉴定目的基因根据目的基因特异性表达进行分离有的基因只有在某生物的一定的生长发育阶段或一定的器官中才能表达，这样的基因可用此方法获得。例如，待分离的目的基因只有在植物的根中才能有效表达，而在其他器官中（如植物的叶）不能表达，因此用根构建的cDNA文库中含有携带目的基因cDNA的克隆子。根据这一性质以根和叶的总mRNA(或它们的cDNA)为探针，分别对根构建的cDNA文库进行杂交比较。用根的总mRNA(或它们的cDNA)制备的探针对cDNA文库进行杂交时，所有克隆子都呈阳性反应；而用叶的总mRNA(或它们的cDNA)制备的探针进行杂交时，根cDNA文库中的某些克隆子呈阴性反应。最后比较2份杂交结果，便可以在根cDNA文库转膜的大量菌落中挑选出含目的基因的菌落（图2-22）。将这种分离目的基因的方法称为差别杂交筛选法，这种方法也可用于分离受生长因子调节的基因及特殊处理诱导表达的基因。图2-22差别杂交筛选示意图细胞。无论是原核生物细胞还是真核生物细胞都可作为受体细胞，但不是所有的细胞都可以作为受体细胞。选用受体细胞时应考虑以下几点：①便于外源DNA分子的导入，并在其内能稳定维持。②便于克隆子（转化子）的筛选。③遗传性稳定，对遗传密码的应用上没有明显对遗传密码的应用上无明显偏倚性，适于外源基因的高效表达、表达产物的分泌或积累；对于真核生物目的基因的高效表达，还应具有较好的翻译后加工机制。④易于扩大培养或发酵生长，具有较高的生产应用价值和理论研究价值。⑤安全性高，不会对外界环境造成生物污染。一、原核生物细胞原核生物细胞是较为理想的受体细胞（图2-5-1），其原因是：①大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的导入。②没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，便于外源DNA与裸露的染色体DNA重组。③基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。④原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。因此原核生物细胞普遍作为受体细胞用来构建基因组文库和cDNA文库，或者作为克隆载体的宿主菌，或者用来建立生产某种目的基因产物的工程菌。但是，以原核生物细胞来表达真核生物基因也存在一定的缺陷，很多未经修饰的真核生物基因往往不能在原核生物细胞内表达出具有生物活性的功能蛋白。但是通过对真核生物基因进行适当的修饰，或者采用cDNA克隆等措施，原核生物细胞仍可用作表达真核生物基因的受体细胞。至今被用作受体细胞的原核生物主要是大肠杆菌（Escherichiacoli）。此外，乳酸菌(lacticacidbacterium)、枯草杆菌（Bacillussubtilis）、棒状杆菌(corynebacterium)和蓝细菌(cyanobacterium)等也被用作受体细胞。图2-5-1原核生物细胞模式图二、真核生物细胞真核生物细胞具备真核生物基因表达调控和表达产物加工的机制，因此作为受体细胞表达真核生物基因优于原核生物细胞。真菌、植物和动物的细胞都被用作基因工程的受体细胞。酵母菌属于单细胞真菌，是外源真核生物基因理想的表达系统。酵母菌作为基因工程受体细胞，除了真核生物细胞共有的特性外，还具有以下优点：①基因结构相对比较简单，对其基因表达调控机制研究得比较清楚，便于基因工程操作。②培养简单，适于大规模发酵生产，成本低廉。③外源基因表达产物能分泌到培养基中，便于产物的提取和加工。④不产生毒素，是安全的受体细胞。植物细胞作为基因工程受体细胞（图2-5-2），除了真核生物细胞共有的特性外，最突出的优点就是其全能性，即一个分离的活细胞在合适的培养条件下，比较容易再分化成植株，这意味着一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株。不足之处是植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁，不利于摄取重组DNA分子。但是采用农杆菌介导法或用基因枪、电激仪处理等方法，同样可使外源DNA进入植物细胞。现在用作基因工程受体的植物有水稻、小麦、玉米、大豆、马铃薯、棉花、烟草和拟南芥等。图2-5-2植物细胞模式图动物细胞作为受体细胞（图2-5-3），同样便于表达具有生物活性的外源真核生物基因产物。不过早期由于对动物的体细胞全能性的研究不够深入，因此多采用生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞作为基因工程的受体细胞，获得了一些转基因动物。近年来，由于对干细胞的深入研究和多种克隆动物的获得，表明动物的体细胞同样可以用作转基因的受体细胞。目前用作基因工程受体的动物有猪、羊、牛、鱼、鼠、猴等。图2-5-3动物细胞模式图目前用于重组DNA分子导入受体细胞的方法很多，具体采用那一种方法，应根据选用的载体系统和受体细胞类型而定。一、外源DNA转化方法通过生物学、物理学和化学等方法使外源裸露DNA分子引入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为转化(transformation)。如果引入受体细胞的是经包装处理带有外源DNA分子的病毒或噬菌体颗粒，此过程称为转染(transfection)。下面介绍几种比较常用的转化方法。（1）化合物诱导转化法用二价阳离子（如Mg2+、Ca2+、Mn2+）处理某些受体细胞．可以使其成为感受态细胞，即处于能摄取外源DNA分子的生理状态的细胞。当外源DNA分子溶液同感受态细胞混合时，DNA分子便可进入细胞，达到转化的目的。有的动物细胞能捕获粘附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。根据这一特性，先将待转化的外源DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，在强烈振荡下缓慢加入缓冲液，形成DNA-磷酸钙共沉淀复合物，然后用吸管将沉淀复合物加入到哺乳动物单层培养细胞的表面上，保温几小时后，可使外源DNA进入细胞。外源DNA与某些多聚物和二价阳离子混合，再与受体细胞或原生质体混合，也可使外源DNA进入细胞。常用的多聚物有聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等，尤以PEG应用最广，可用于原核生物细胞、动物细胞和植物原生质体的基因转化。（2）根癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法含有Ti质粒的根癌农杆菌与一些植物的细胞接触后，Ti质粒的一部分(T-DNA)导入植物细胞，整合到植物基因组DNA，随基因组DNA的复制而复制（图2-5-4）。根据这一特性构建了一系列Ti质粒载体，与含目的基因的DNA片段重组，导人根癌农杆菌，再采用叶盘转化法、原生质体共墙养法和悬浮细胞共培养法，通过根癌农杆菌介导进入植物细胞。用根癌农杆菌介导法己获得了一些转基因植物，但是通过此方法转化获得转基因单子叶植物比较困难。图2-5-4根癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化（3）微弹轰击转化法微弹轰击转化法又称基因枪转化法，这是通过高速运行的金属颗粒轰击细胞，将包裹在金属颗粒表面的外源DNA分子随金属颗粒导入细胞的转化方法（图2-5-5）。基因枪法简单快速，可直接处理植物组织，接触面积大，并有较高的转化率。图2-5-5基因枪法转移外源基因（4）脂质体介导法

脂质体(liposome)是由磷脂双分子层组成的人工膜状结构，将DNA分子包在其内,通过脂质体与与原生质体的吞噬过程，将外源DNA导入受体细胞内（图2-5-6）。此方法的优点是在脂质体内的DNA可以避免细胞内核酸酶的降解，因此可直接转化外源DNA。图2-5-6脂质体介转化（5）花粉管通道转化法此方法只用于植物。植物授粉过程中，将外源DNA涂在柱头上，使DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化还不具正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎细胞。由于这一方法技术简单，易于掌握，能避免体细胞变异等优点，具有一定的应用前景。图2-5-7花粉管通道法导入外源基因（6）精子介导法此方法只用于动物，是指精子同外源DNA共浴后再给卵子受精，使外源DNA通过受精过程进入受精卵并整合于受体的基因组中。近年来还采用了电穿孔、脂质体包埋等辅助手段，提高了精子介导法的可靠性和可行性。二、病毒（噬菌体）颗粒转导法用病毒（噬菌体）的DNA（或RT-DNA）构建的克隆载体（或携带目的基因），在体外包装成病毒（噬菌体）颗粒后，感染受体细胞，使其携带的重组DNA进入受体细胞，将此过程称为病毒（噬菌体）颗粒转导(transduction)法。该方法主要用于动物的转基因，早期也用于植物的转基因。病毒（噬菌体）颗粒转导法主要是用经包装处理带有目的基因的病毒（噬菌体）颗粒直接感染受体细胞，使目的基因随同病毒（噬菌体）DNA分子整合到受体细胞染色体DNA上，这样以后不必再包装成病毒（噬菌体）颗粒。如果带有目的基因的病毒（噬菌体）是缺陷型的，则需同另一辅助病毒（噬菌体）一起感染受体细胞，在受体细胞内包装成新的病毒（噬菌体）颗粒。但是，如果受体细胞的基因组中早已整合有病毒（噬菌体）缺陷的DNA片段，则没有必要用辅助病毒做混合感染。通常将摄取外源DNA分子并在其中稳定维持的受体细胞称为克隆子。重组DNA分子在转化或转染过程中，一般仅有少数受体细胞成为转化子。因此，必须采用合适的方法从大量的受体细胞背景中筛选出期待的转化子。一、根据载体标记基因筛选转化子在构建基因工程载体时，通常在载体DNA分子中组装一种或两种选择标记基因，在受体细胞内表达后，呈现出特殊的表型或遗传学性状，作为筛选转化子的依据。一般的做法是将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在适宜的生长条件下培养一定时间，根据受体细胞生长的情况挑选出转化子。（1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子这是筛选大肠杆菌转化子最常用的方法。相关的基因和选择药物见表2-1。表2-1筛选大肠杆菌转化子的部分抗生素抗性基因和相应的选择药物此外，有些抗生素抗性基因可用于筛选动植物转化子。携带新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)的转化子抗新霉素、卡那霉素和庆大霉素等抗生素，成为筛选动植物转化子的选择标记基因。潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）赋予转化子能抗潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。氯霉素酰基转移酶基因(cm)也被用于筛选动植物转化子的标记基因。（2）根据载体除草剂抗性基因和相应的选择药物筛选转化子由于植物细胞对多数抗生素不敏感，因此常用抗除草剂的基因作为选择标记基因（图2-5-8）。pat基因编码磷化乙酰转移酶(PAT)，使转化子对含有磷化麦黄酮(PPT)成分的除草剂具有抗性。epsps基因表达产物是5-烯醇丙酮酸莽草酸-3磷酸合成酶(EPSPS)突变体，使转化子能抗草甘膦。图2-5-8利用除草剂筛选转基因水稻（3）根据lacZ'基因互补显色试剂筛选转化子此方法主要用于原核生物。lacZ'是β-半乳糖苷酶基因部分缺失的DNA片段，含lacZ'的重组载体转化lacZ'互补型菌株，可翻译β-半乳糖苷酶，在含有X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）的培养基上使转化子成为蓝色菌落（图2-5-9），而lacZ'互补型菌株本身为白色菌落。当载体的lacZ'区插入外源基因后，再转化lacZ'互补型菌株，由于不能翻译β-半乳糖苷酶，转化子即使在含有X-gal和IPTG的培养基上也只能长成白色菌落。这样可以区分含外源基因和不含外源基因的转化子。图2-5-9利用lacZ'重组载体转化蓝白筛选二、根据报道基因筛选转化子报道基因多数是酶的基因，或者组装在载体中，或者作为外源DNA的一部分。由于受体细胞内报道基因的表达，出现新的遗传性状，以此识别被转化的细胞与未被转化的细胞。作为报道基因，其表达产物应是便于检测和定量分析，并且灵敏度很高。（1）β-葡萄糖酸苷酶基因（gus）gus基因表达产物β-葡萄糖酸苷酶(GUS)能够催化4-甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸，产生荧光物质4-甲基伞形花酮，以此筛选含gus基因的转化子（图2-5-10）。由于植物细胞GUS本底非常低，因此广泛地应用于筛选植物转化子。尤其是gus基因的3'端与其他结构基因连接产生的嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在转化生物体中的定位分析。图2-5-10转gus基因棉花胚状体（2）萤火虫荧光素酶基因(luc)luc基因表达产物萤火虫荧光素酶(LUC)在Mg2+的作用下，可以与荧光素和ATP底物发生反应，形成与酶结合的腺苷酸荧光素酰化复合物，经过氧化脱羧作用后，该复合物转变成为处于激活状态的氧化荧光素，可以用荧光测定仪快速灵敏地检测出产生的荧光（图2-5-11），是目前作为研究动植物转基因很好用的一种报道基因。图2-5-11转荧光素酶基因烟草（3）绿色荧光蛋白基因(gfp)当绿色荧光蛋白暴露于395nm波长的灯光下，便会被激发出绿色荧光（图2-5-12）。此基因已广泛地作为筛选动植物转化子的报道基因。图2-5-12转gfp基因小鼠三、根据形成噬菌斑筛选转化子对于λDNA载体系统而言，外源DNA插入λ噬菌体载体后，重组DNA分子大小必须在野生型λDNA长度的75%-105%内，才可以在体外包装成具有感染活性的噬菌体颗粒。构建的λDNA载体本身的大小一般都小于野生型λDNA长度的75%，不能在体外包装成具有感染活性的噬菌体颗粒。因此，外源DNA与λDNA载体重组处理后，只有重组DNA分子才能体外包装和转染受体菌，在培养基上形成噬菌斑，并且未转染的受体菌继续正常生长（图2-5-13）。图2-5-13利用噬菌斑筛选转化子经筛选获得的转化子常伴随着一些假阳性细胞或个体，为了确定获得的转化子是预期的转化子，还需检测转化子中的重组DNA分子、目的基因转录的mRNA和翻译的多肽。一般将真正含有预期重组DNA分子的转化子称为重组子。一、根据重组DNA分子检测结果来鉴定重组子为鉴定转化子是真正预期的转化子，即重组子，首先必须检测获得的转化子中是否存在预期的重组DNA分子。检测方法有如下5种。（1）检测重组DNA分子的大小和限制性内切核酸酶酶切图谱根据插入外源DNA片段的载体与原载体DNA分子之间有大小之别。分别提取获得的不同转化子的DNA，经琼脂糖凝胶电泳，由于载体DNA中插入了外源DNA片段，其分子质量大于原载体DNA分子，在琼脂糖凝胶板上的DNA条带中，若出现落后的条带，则表明原载体DNA分子中插入了外源DNA片段，是重组DNA分子的条带。在此基础上，从初步鉴定为重组子的转化子中提取DNA，用合适的限制性内切核酸酶酶切，经琼脂糖凝胶电泳，获得酶切图谱，如果酶切片段的数量和大小同预期的一致，则可进一步确定被检测的转化子是预期的重组子。（2）PCR方法扩增外源DNA片段由于在载体DNA分子中，外源DNA插入位点的两侧序列多数是已知的，可以设计合成相应的PCR引物，并且分别从获得的不同转化子提取DNA，以此作为模板进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳（图2-5-1），若出现特异性扩增DNA带，并且其DNA片段大小同预先插入的外源DNA-致，则可确定待鉴定的转化子是预期的重组子。图2-5-14PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图（3）采用DNA杂交法鉴定重组子当两个不同来源的单链DNA分子（DNA片段）的核苷酸序列互补时，在复性条件下可以通过碱基互补配对成为双链“杂种”DNA分子，即DNA杂交。分别从获得的不同转化子提取总DNA，经过变性处理成为单链DNA分子，用预先根据待检测的重组DNA分子制备的DNA探针与其杂交，进一步根据标志物枪测杂交的DNA片段，出现阳性杂交的转化子是预期的重组子。杂交的方法有Southern印迹杂交（图2-5-15）、斑点印迹杂交和菌落（或噬菌斑）原位杂交等。图2-5-15Southern印迹杂交流程图（4）应用DNA芯片鉴定重组子DNA芯片是利用固定化的探针阵列与样品杂交，通过荧光扫描和计算机分析，获得样品中大量基因及表达信息的一种高通量生物信息分析技术。DNA芯片又称为DNA阵列(DNAarray)或寡核苷酸微芯片(oligonucleotidemicrochip)等。使用DNA芯片的步骤（图2-5-16）：①提取、纯化待测材料的DNA或RNA样品，并用荧光予以标记，与基因芯片进行分子杂交。②经过杂交，与探针互补的样品结合后，呈现阳性荧光信号，通过激光扫描，将大量并行采集的信号传送至计算机系统进行处理鉴定。图2-5-16DNA芯片检测步骤（5）根据DNA核苷酸序列鉴定重组子通过以上方法在获得的转化子中证实含有预先设计的外源DNA片段后，可以对外源DNA片段进行核苷酸序列的测定进一步确认。如果测定结果与原设计的外源DNA片段的核苷酸序列完全一致，表明待鉴定的转化子是真正的重组子。二、根据目的基因转录产物mRNA鉴定重组子获得的转化子还可以从外源基因转录水平进行鉴定。利用Northern杂交技术可以检测外源基因是否转录出mRNA。Northern杂交的过程类似于Southern杂交，不同的是用DNA探针检测RNA分子。从获得的转化子中提取总RNA并纯化mRNA，然后将RNA转移到供杂交的膜上，用预先根据待检测mRNA序列合成的同源DNA探针或cDNA探针与其杂交，出现阳性杂交带的转化子是外源基因能有效转录的重组子。斑点印迹杂交法和菌落（或噬菌斑）原位杂交法也同样适用于从mRNA水平鉴定重组子。此外，检测外源基因转录产物还可采用反转录一聚合酶链反应(RT-PCR)的方法。从获得的转化子中提敢总RNA或mRNA，然后以它作为模板进行反转录，再进行PCR扩增，若获得了特异的cDNA片段则表明外源基因在转化子中已进行转录。三、根据目的基因表达产物鉴定重组子如果能检测到转化子中目的基因的表达产物，根据基因与表达产物蛋白质（酶、多肽）对应关系，同样能鉴定该转化子是含有目的基因的重组子。检测目的基因表达产物的方法主要有凝胶电泳检测法、免疫学检测法和质谱分析法等。（1）蛋白质凝胶电泳法鉴定重组子如果转化子含有的外源基因能够正确表达，在总的表达产物中增加了外源基因表达的蛋白质（多肽），因此对从转化子中提取的总蛋白质进行凝胶电泳时（图2-5-17），电泳图谱上会出现新的、与预期分子质量一致的蛋白质带，根据这一现象就可以初步鉴定是重组子。图2-5-17蛋白质凝胶电泳图（2）免疫检测法鉴定重组子免疫检测法是以目标蛋白质为抗原，用对应的特异性抗体鉴定重组子的方法。免疫学检测法具有专一性强、灵敏度高的特点。对特定基因表达产物的免疫学检测法主要有酶联免疫吸附法、Western印迹法（图2-5-18）、固相放射免疫法、免疫沉淀法等。图2-5-18Western印迹一般流程（3）质谱分析法当转化子中外源基因表达的蛋白质的量很少，难以用上述方法鉴别时，可采用质谱分析技术，从转化子的蛋白质组“汪洋大海”中检测是否存在新的成员，如果从转化子的总蛋白质中检测到外源基因表达的蛋白质，则可确定待分析的转化子是重组子。细胞工程就是在细胞水平研究开发、利用各类细胞的技术。科学家亦可以根据设计，改变细胞的遗传基础，以及通过无菌操作，大量培养细胞、组织乃至完整的个体；也可以通过大量培养细胞获取它们的代谢产物。迄今为止，人们已经从染色体水平、细胞器水平以及细胞水平开展了多层次的大量工作，在细胞培养、细胞融合、细胞代谢物的生产、干细胞研究和生物克隆等诸多领域取得一系列令人瞩目的成果。一、基础知识细胞是细胞工程操作的主要对象。生物界有两大类细胞：原核细胞与真核细胞。细菌、放线菌等细胞属于原核细胞。它们的细胞小，DNA环状、不与蛋白质结合而裸露于细胞质中。胞内无膜系构造的细胞器。胞外由肽聚糖组成细胞壁，它是细胞融合的主要障碍。不过原核细胞生长迅速，无蛋白质结合的DNA易于人们进行遗传操作，因此它们是细胞改造的良好材料。真菌和动植物等细胞属于真核细胞，体积较大，内有细胞核和众多膜系构造的细胞器。植物细胞外还有以纤维素和半纤维素为主要成分的细胞壁。真菌的细胞壁主要由各种葡聚糖构成网状纤维物。真核细胞一般都有明显的细胞周期，处于有丝分裂时期的染色体呈现高度螺旋紧缩状态，既不利于基因克隆，也难于插入外源基因。因此采取一定的措施诱导真核细胞同步生长，对于成功地进行细胞融合及细胞代谢产物的产生具有十分重要的作用。二、基本操作（1）无菌操作技术细胞工程的所有实验都要求在无菌条件下进行，稍有疏忽都可能导致实验失败。因此实验人员一定要有十分严格的无菌操作意识。实验操作应在无菌室内进行。无菌室要定期用紫外线或化掌试剂消毒，实验前后还应各消毒一次。无菌室外有缓冲室，实验人员在此换鞋、更衣、戴帽，做好准备后方可进入无菌室。此外，还应注意周围环境的卫生整洁。超净工作台是最基本的实验设备，一切操作都应在超净台上进行才能达到较高的无菌要求。对生物材料进行彻底的消毒与除菌是实验成功的前提，实验所用的一切器械、器皿和药品都应进行灭菌或除菌，实验者的双手应戴无菌手套或仔细消毒。实验者一定要十分认真细心地把好这道关，以保证无菌操作的顺利进行。（2）细胞培养技术细胞培养是指动物、植物或微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。虽然这些细胞培养在营养要求等方面有许多差异，但它们也有共同之处。首先，要取材和除菌。除了淋巴细胞可直接抽取以外，植物材料在取材后，动物材料在取材前都要用一定的化学试剂进行严格的表面清洗、消毒，有时还需借助某些特定的酶对材料进行预处理，以期得到分散生长的细胞。其次，根据各类细胞的特点，配制细胞培养基，对培养基进行灭菌或除菌。采用无菌操作技术，将生物材料接种于培养基中。最后，将接种后的培养基放入培养室或培养箱中，提供各类细胞生长所需的最佳培养条件，如温度、湿度、光照、氧气及二氧化碳等。当绌胞达到一定生物量时应及时收获或传代。（3）细胞融合技术两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。细胞融合是细胞工程的重要基本技术，其主要过程包括以下3个步骤（图3-1）。图3-1细胞融合基本过程①制备原生质体由于微生物及植物细胞具有坚硬的细胞壁，因此通常需用酶将其其细胞壁降解。动物细胞则无此障碍。②诱导细胞融合两亲本细胞（原生质体）的悬浮液调至一定细胞密度，按1:1或其他特定的比例混合后，逐渐滴入高浓度的聚乙二醇(PEG)或其他诱导剂诱导融合，或用电激的方法促进融合。③筛选杂合细胞将上述混合液移到特定的筛选培养基上，让杂合细胞有选择地长出，其他未融合细胞无法生长。借此获得具有双亲遗传特性的杂合细胞。组织培养是在无菌和人为控制外因（营养成分、光照、温度、湿度）的条件下，培养、研究植物组织、器官，甚至进而从中分化、发育出整体植株的技术。植物组织培养的历史可以追溯到20世纪初，当时德国植物学家Haberlandt就曾预言“植物细胞具全能性”。现在已有多种具重要经济价值的粮食作物、蔬菜、花卉、果树、药用植物等实现了大规模的工业化、商品化生产。进行植物组织培养，一般要经历以下5个阶段（图3-2）。图3-2植物组织培养过程一、预备阶段（1）选择合适的外植体

外植体，即能被诱发产生无性增殖系的器官或组织切段，如一个芽，一节茎。选择外植体，要综合考虑以下几个因素：①大小适宜，外植体的组织块要在2万个细胞（即5-l0mg）以上才容易成活。②同一植物不同部位的外植体的分化能力、分化条件及分化类型有相当大的差别。③植物胚和幼龄组织器官比老化组织器官更容易去分化，产生大量的愈伤组织。愈伤组织原意指植物因受创伤而在伤口附近产生的薄壁组织，现已泛指经细胞与组织培养产生的可传代的未分化细胞团。④不同物种相同部位的外植体细胞分化能力可能大不一样。总之，外植体的选择，一般以幼嫩的组织或器官为宜。此外，外植体的去分化及再分化的最适条件都需要摸索。他人在某种植物中成功的组织培养经验只可供借鉴，并无快捷方式可循。（2）除去病原菌及杂菌选择外观健康的外植体，尽可能除净外植体表面的各种微生物是成功进行植物组织培养的前提。消毒剂的选择和处理时间的长短与外植体对所用试剂的敏感性密切相关。通常幼嫩材料处理时间比成熟材料要短些。对外植体除菌的一般程序：外植体——自来水多次漂洗——消毒剂处理——无菌水反复冲洗——无菌滤纸吸干。（3）配制适宜的培养基虽然由于物种的不同，外植体的差异，组织培养的培养基多种多样，但它们通常都包括以下3大类组分：①含量丰富的基本成分（如蔗糖或葡萄糖高达每升30g）及氮、磷、钾、镁等；②微量无机物，如铁、锰、硼酸等；③微量有机物，如吲哚乙酸、激动素、肌醇等。

各培养基中，吲哚乙酸和激动素的变动幅度很大，这主要因培养目的而异。一般较高的生长素（吲哚乙酸）与细胞分裂素（激动素）比值有利于诱导外植体产生愈伤组织，反之则促进胚芽和胚根的分化。二、诱导去分化阶段外植体是已分化成各种器官的切段。组织培养的第一步就是让外植体去分化，使各细胞重新处于旺盛有丝分裂的分生状态，因此培养基中一般应添加较高浓度的生长素类激素。诱导外植体去分化可以采用固体培养基（在培荞基中添加琼脂0.8%～1.0%）。外植体表面除菌后，切成小片（段）插入或贴放培养基表面即可。但外植体营养吸收不均、气体及有害物质排换不畅，愈伤组织易出现极化现象（根和芽过早发育）是本方法的主要缺点。如果把外植体浸没于液态培养基中，营养吸收及物质交换便捷，但需提供振荡器等设备。本阶段为植物细胞依赖培养基中的有机物等进行的异养生长，原则上无需光照。但人们通常还是把它们置于人工照明条件下培养，以期得到绿色愈伤组织。三、继代增殖阶段愈伤组织长出后经过4-6周的迅速细胞分裂，原有培养基中的水分及营养成分多已耗失，细胞的有害代谢物已在培养基中积累，因此必须进行移植，或切割成数块后移植，即继代增殖。同时，通过移植，愈伤组织的细胞数大大扩增，有利于下阶段收获更多的胚状体或小苗。四、生根发芽阶段愈伤组织只有经过重新分化才能形成胚状体，继而长成小植株。所谓胚状体指的是在组织培养中分化产生的具有芽端和根端类似合子胚的构造。通常要将愈伤组织移置含适量细胞分裂素，没有或仅有少量生长素的分化培养基中，才能诱导胚状体的生成。光照是本阶段的必备外因。根据实验工作的需要，有时也可不经愈伤组织阶段而直接诱导外植体分生、分化长成一定数量的丛生芽。然后再诱导其生成根。五、移栽成活阶段生长于人工照明玻璃瓶中的小苗，要适时移栽室外以利生长。此时的小苗还十分幼嫩，移植应在能保证适度的光照、温度、湿度条件下进行。在人工气候室中锻炼一段时间（称为炼苗）能大大提高幼苗的成活率。植物中含有大量的次生代谢物质。据保守估计，目前已发现的植物天然代谢物已超过3万种，而且每年还有大量新的代谢物被发现。根据化学结构的差异一般将这些次生代谢物划分为酚类、萜类和含氮化合物3大类。早在1956年，Routier和Nickell就提出工业化培养植物细胞以提取其天然产物的大胆设想。1968年，Reinhard等首先将这种设想转变成现实，生产出了哈尔碱(harmine)。随后，Kaul等（1969）、Furuya等（1972）、Teuscher等（1973）分别培养植物细胞获取了其中的薯蓣皂苷、人参皂角苷和维斯纳精(visnagin)。现在，一些发达国家已集中相当数量的人力、财力潜心开拓这个经济潜力十分巨大的生产领域。工业化植物细胞培养系统主要有两大类：悬浮细胞培养系统和固定化细胞培养系统。前者适于大量快速地增殖细胞，但往往不利于次生代谢物的积累；后者则相反，细胞生长缓慢，但