槐米中总黄酮的含量测定

槐米中总黄酮的含量测定

蝗虫是豆类科的一种蝗虫科植物。它的化学成分为冷血止血、清肝泻火。用于便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、衄血、肝热目赤、头痛眩晕。黄酮类物质具有增加脑血流量及冠脉血流量的作用,可用于缓解高血压症状(颈项强痛)、治疗心绞痛及突发性耳聋,并能有效地激发脑活力,对提高青少年智力产生积极作用,并且能有效抑制成人及老年人的脑功能衰退,具有广阔的应用前景。槐米中含有多种黄酮类物质,如芦丁、槲皮素等。黄酮类指两个苯环中间通过三碳链连接形成C6~C3~C6基本骨架的一类化合物的总称。结构见图1。由于黄酮类化合物分子中常含有下列结构单元,结构单元见图2,故常可与铝盐、铅盐、镁盐等试剂反应,生成有色配位化合物。芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶,含有三分子的结晶水,结构式见图3。熔点为174~178℃,无水物188~190℃。溶解度:冷水中为1∶10000;热水中1∶200;冷乙醇1∶650;热乙醇1∶60;冷吡啶1∶12。微溶于丙酮、乙酸乙酯,不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚,溶于碱而呈黄色。槲皮素的二水合物,结构式(见图4),为黄色针状结晶(稀乙醇),在95℃~97℃成为无水物,熔点314℃(分解)。1g溶于290mL无水乙醇,23mL沸乙醇,溶于冰醋酸,碱性水溶液呈黄色,几乎不溶于水,乙醇溶液味很苦。由于黄酮的成分复杂,且其各自的具体功效作用还未确定,因此测定总黄酮是非常必要的。对于槐米提取物中总黄酮含量的测定,一般采用传统的紫外分光光度法(或者称为化学比色法)、一阶导数分光光度法、高效液相色谱法、偶氮显色反应和荧光法等等。比色法是被一些药典所采用的最常用的总黄酮测定方法。这种方法以硝酸铝、亚硝酸钠为显色剂,利用其与黄酮类物质生成的红色铝螯合物为特征,在500nm波长附近测定其吸收光谱,并以芦丁为标准品进行对照,从而得到待测物质的总黄酮含量。就槐米中总黄酮含量的测定而言,目前采用比较多的仍然是比色法。一般而言,色谱等方法,对实验条件要求高,且实验经费消耗较大,过程较复杂,由于化学比色法简单易行,对设备要求低,因此该法仍被作为槐米中总黄酮含量最常用的测定方法。1机器、材料和试剂1.1芦丁标准品槐米(购买于盐城市中药饮片有限公司批号20070817),芦丁标准品(中国药品生物制品检定所,批号1000802200710)。1.2试剂5%亚硝酸钠溶液,60%乙醇溶液,10%硝酸铝溶液,1mol·L-1的氢氧化钠溶液,饱和石灰水,浓盐酸,2%的硫酸溶液。1.3紫外分光光度计及配套比色器仪器数显恒温水浴锅(郑州长城科工贸有限公司),循环水式多用真空泵(常州国华电器有限公司),AL240~METTLERTOLEDO电子天平,UV~4802型双光束紫外可见分光光度计及配套比色皿(UNICO(上海)仪器有限公司)。2实验方法2.1水浴加热溶解精密称取10mg芦丁标准品到烧杯中,加少量水,水浴加热使之部分溶解,将溶液转移入100mL容量瓶中。剩余在烧杯中的固体继续加水溶解,并转移到容量瓶中。重复此步骤,直到所有芦丁均转移至容量瓶中。将容量瓶置于水浴中加热,直到溶液完全澄清为止。冷却后,定容至100mL,摇匀,即得0.1mg·mL-1的芦丁标准液。2.2硝酸盐铝溶液的配制移取芦丁对照品溶液5mL,置50mL容量量瓶中,用60%的乙醇溶液补充至约25mL,先加5%的亚硝酸钠溶液1.5mL,摇匀,放置6min;再加10%的硝酸铝溶液1.5mL,摇匀,放置6min;再加1mol·L-1的氢氧化钠溶液20mL,用水稀释至刻度,放置20min,在200~800nm波长范围内扫描,确定最大吸收波长为510nm。结果(见图5)。2.3浓度cmgml-1的线性回归法用移液管精密吸取5.0mL、10.0mL、15.0mL、20.0mL、25.0mL的芦丁标准液分别置于50mL的容量瓶中,用60%的乙醇溶液补充至约25mL,先各加5%的亚硝酸钠溶液1.5mL,摇匀,放置6min;再各加10%的硝酸铝溶液1.5mL,摇匀,放置6min;再各加1mol·L-1的氢氧化钠溶液20mL,用水稀释至刻度,放置20min,在510nm处测定吸光度,以吸光度A对浓度c(mg·mL-1)进行线性回归。测得芦丁溶液浓度及对应的吸光度,浓度(mg·mL-1)为0.0128,0.0256,0.0384,0.0512,0.0640的吸光度分别为0.301,0.602,0.906,1.211,1.483。线性关系良好(见图6)。其标准曲线的回归方程为:A=23.227c+0.0087,相关系数R=0.9998。式中:A-吸光度;c-芦丁浓度,mg·mL-1。2.4芦丁溶液的制备取槐米20g,置烧杯中,加200mL水,煮沸;60℃水浴,加入饱和石灰水至pH=10,保持30min;反复减压抽滤3次,合并滤液;在60℃条件下,用浓盐酸调至pH=4,放置24h,抽滤;沉淀物水洗至中性,60℃干燥得芦丁粗品;以1:200加入水,沸水重结晶30min,抽滤;70℃干燥沉淀,得芦丁纯品。精密称取10mg获得的芦丁纯品到烧杯中,按对照品溶液的配制方法,配制样品溶液。精密移取5mL样品溶液至50mL容量瓶中,添加60%乙醇溶液使体积约为25mL,按标准曲线的制备方法,依次加入5%亚硝酸钠溶液、10%硝酸铝溶液和1mol·L-1的氢氧化钠溶液,静置20min,在510nm处测定吸光度,并记录数据。3结果和分析3.1样品测定结果精密移取5mL芦丁标准液,然后按标准曲线的制备方法,依次加入5%亚硝酸钠溶液、10%硝酸铝溶液和1mol·L-1的氢氧化钠溶液,静置20min,在510nm处测其吸光度值。重复五次实验。结果5个样品的吸光度分别为0.313、0.311、0.312、0.309、0.310。RSD=0.50%,说明精密度良好。3.2显色检测测定结果取同批样品20g,共5份,精密称定,按样品的测定方法平行制备样品溶液5份,各取5mL按显色检测液制备方法在510nm处测定吸光度。结果(见表1)。RSD=0.49%,说明重现性是良好的。3.3吸光度测定精密量取芦丁溶液5mL两份,置50ml容量瓶中。1份加水至刻度作为空白对照,另1份分别在0,5,10,15,20,25,30min时依法测定吸光度,吸光度分别为0.311、0.313、0.313、0.312、0.312、0.313、0.312。RSD=0.24%,表明在30min内测定是稳定的。3.4吸光度的测定取同批样品20g,共5份,精密称定,按样品的测定方法平行制备样品供试液5份,各取5mL按显色检测液制备方法在510nm处测定吸光度。根据回归方程,计算出各自的浓度,从而得到各自的含量。结果5个样品的含量测定分别为4.9%、5.0%、4.9%、5.0%、4.9%。RSD=1.1%,说明该方法测得的含量是可靠的。4比色定量的确定4.1黄酮类化学结构为2-苯基色原酮,分子中具有酚羟基,故常可与铝盐、铅盐、锆盐、镁盐、锶盐、铁盐等试剂反应,生成有色络合物。与硝酸铝溶液反应,生成的络合物多为黄色,并有荧光,可用于定性及定量分析,在一定浓度范围内,其浓度与吸光度符合比尔定律,可进行比色定量。本试验中,加入了一系列的预试验,才能确定了本次试验的影响因素及条件。4.2按实验方法,分别加入0.5~3.0mL(间隔为0.5mL)10%硝酸铝溶液,测定A值。结果表明:用量在1.0~2.0mL之间时A值基本不变,本实验选择硝酸铝溶液用量为1.5mL。4.3按实验方法,分别加入0.5~3.0mL(间隔为0.5mL)5%亚硝酸钠溶液,测定A值,结果表示用量在0.5~2.5mL之间时A值基本不变,本实验选择亚硝酸钠溶液用量为1.5mL。介质pH在12~14时,吸光度基本不变,本实验选pH=13,此时选择加入1mol·L-1的氢氧化钠溶液20mL。按实验方法,每隔5min测定一次A值,A值在10~30min内基本保持不变。本实验选择20min为显示时间。5方法与被测物质的相关性5.1