浓香型白酒发酵糟中还原糖测定方法的研究

浓香型白酒发酵糟中还原糖测定方法的研究

浓香酒是一种奇怪的酒，在中国酒精饮料中占有重要地位。传统浓香型白酒采用固态法酿酒,糖化和发酵在发酵糟醅中同时进行,形成了栖息在窖池糟醅、窖泥中的庞大微生物区系在糟醅固、液、气三相界面间的复杂物质、能量代谢和信息传递过程。在这一过程中,淀粉质酿酒原料降解和转化为可发酵糖(主要为还原糖)并生成乙醇,同时还生成高级醇、有机酸、酯类、醛类、酮类以及其他一些大分子物质。因此,发酵糟醅中糖类的动态变化不仅间接反应窖池中乙醇的生成情况和发酵状况,而且可以特征反映窖池中微生物的生命活动状况。在一般发酵工业及传统酿造企业,包括质量技术检验部门,测糖的经典化学方法是斐林试剂(Fehling)法,如Lane—Eylon法和Bertrand法。该方法具有准确度高、重现性好等优点,但步骤多、操作繁,对操作人员熟练程度要求较高,否则易造成较大误差。而分光光度法不仅操作简便,与其他仪器分析方法(如HPLC法,电极电位测定法,流动注射分析法)相比,不需高档分析测试仪器,准确度也能达到分析要求,并且能用于半微量或微量分析,近年来在糖类测定中应用较多。但对不同的显色原理,选定的显色剂各不相同;而且对于同一种显色剂,如3,5-二硝基水杨酸(简称DNS),也会因不同测定样品中一些物质会对还原产物产生吸光干扰,检测时选定的测定波长也各不相同。在对白酒发酵糟醅的研究中,利用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖时,如何消除白酒发酵糟醅中的干扰物质影响,建立快速、准确的测定方法,对于监控窖池发酵糟醅发酵状况,指导白酒生产以及进一步研究窖池的物质能量转化关系具有重要的意义。1材料和方法1.1材料表面分析样品:四川泸州老窖酒厂发酵糟醅。1.2主要设备721型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)酸度计(pHS-25C,上海康仪仪器有限公司)1.3ds显色剂的配制0.01g/mL葡萄糖标准溶液:准确称取预先在105℃烘至恒重的葡萄糖0.50g,用水溶解后移于50mL容量瓶中并稀释至刻度。DNS显色剂。以上试剂均为分析纯。1.4实验方法1.4.1样品预处理还原糖样液:取发酵糟醅约10g加100mL蒸馏水制成悬震液,抽滤得到滤液,中和至pH6左右,定容至100mL。1.4.2最大波长od测定取1mL样液和2mLDNS显色剂分别加入1mL水中,沸水浴5min,取出迅速冷却,稀释1倍,以水作参比液,分别在500～650nm波长范围测定OD值。作OD值-波长曲线,选择参比液。1.4.3波长为400mn的多步参比液mL待测液于试管中,加入3,5-二硝基水杨酸4mL,同1.4.2步操作,以1.4.2步所选定的参比液,在波长480nm～650nm测OD值。作OD值-波长曲线,选择最大吸收波长。1.4.4最大吸收波长法取待侧液2mL各加入1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mLDNS显色剂,同1.4.2步操作,以1.4.3步所选定的最大吸收波长测定OD值。作OD值—DNS用量关系图,选择显色剂最佳用量。1.4.5标准曲线的绘制参考文献绘制方法,于1.4.3处所选定的波长处测OD值,绘制OD值—浓度标准曲线。2结果与讨论2.1品液预处理方法对还原糖测定结果的比较在样品悬震、浸出时,考虑到样品中微生物菌体及酶的存在对处理过程中还原糖含量的可能影响,实验中比较了样品液煮沸方法与原不煮沸方法对还原糖测定结果的差异,两种预处理方法的比较结果如表1所示:从表1可以看出两种方法的测定结果误差在0.5%之内,几乎无明显变化。估计是由于样品液处于较酸性(pH3.5)的环境条件下,还原糖含量难于被被微生物、酶等生化因素所影响。因而,采用本文1.4.1不煮沸的预处理方法是可行的。2.2样品液和dna的od测定正确选择参比溶液可以使试液的吸光度真正反映待测物的浓度。在样品液中带有醛基的非还原糖物质以及含氨基的物质对测定结果有较大影响,因此分别选择DNS和样品液,以水作参比在500～650nm波长范围内测定吸光度,结果如图1。由图1可以看出,样品液和DNS的OD值均在测定范围内随波长增大而降低,且在590nm～650nm波长范围内,二者的OD值都很小,不会对还原产物的OD值造成较大的干扰。相对而言,样品液的OD值比DNS的OD值略大一些,因而在还原糖分析测定中,可在590nm～650nm波长范围内选择样品液作为参比液使用。2.3显色剂用量对sds值的影响在显色反应中,根据溶液平衡原理显色剂过量愈多对反应越有利,但是过量的显色剂可能会在样品液中引起副反应。因此在样品液浓度和其他测定条件固定的状态下,加入不同量的DNS,在590nm～650nm波长范围内,选择吸光度最低的600nm波长测定DNS显色剂的OD值,结果如图2。从图2中的曲线可见,加入的DNS在4mL以下,随DNS用量增加,样品反应液的吸光度呈逐渐上升的趋势,说明参与反应的显色剂用量不足。当显色剂用量增加到4mL～6mL时,测定的样品反应液OD值已达到最大并基本稳定不变。因而,可以认为,测定时2mL样品液中加入显色剂DNS的最佳用量是4.0mL,即样品液于DNS显色剂的用量比为1∶2。2.4od值在样品的最大吸收波长选取中,以样品液作参比,取4mLDNS加入到2mL样品液中,在570nm～650nm范围内测定OD值,还原糖与显色剂反应后在不同波长下的吸光度曲线如图3所示。在570nm～650nm波长范围内,样品液中还原糖和DNS反应后产物的OD值表现出较好的波形曲线,并在波长610nm处有最大吸收峰,因此,发酵糟醅还原糖测定实验中,选取610nm作为测定用波长最为合适。2.5还原糖浓度曲线的测定按1.4.5标准曲线绘制方法,配制系列不同浓度标准溶液。以水作参比,分别取4mLDNS各加入到2mL系列浓度的标准溶液中,测定OD值,作OD值-还原糖浓度曲线。结果如图4。图4表明:曲线的线性相关性非常好,对曲线作回归分析得相关系数R=0.9996,回归方程式Y=1.0412X+0.0027,其中Y表示还原糖的浓度,单位g%;X表示测定的吸光度A;0.0027表示补偿参数。3还原糖含量的测定用3,5-二硝基水杨酸—分光光度法分析浓香型白酒发酵糟醅中的糖分含量时,以样品液作为测定的参比液,样品液与DNS显色剂的用量比为1∶2,在610nm处测定OD值,经回归方程式Y=1.0412X+0.0027可快速