高效兼性好氧反硝化细菌的分离鉴定

高效兼性好氧反硝化细菌的分离鉴定

1好氧反硝化细菌的筛选传统理论认为，只有在氧气条件下才能建立反硝化酶系统（bonintal.1989；ferguson1994），生物反硝化过程可以进行。然而，在后来的研究中，一些科学家发现了具有诱导反应的细胞菌，如螺旋体和甲基丙烯酸酯，它们可以在o2条件下反硝化（约瑟夫索顿等人，2002年，乔伊尔安顿等人，2005年）。马放等人（2005）从活性污染的土壤中分离出厌氧反硝化菌gtx1。在好氧条件下，总氮含量超过50%。suetal（2001）可从sm-3型菌株中分离反硝化反应。传统的污水脱氮处理工艺常表现出脱氮效果不理想,因此,常需要对高浓度的含氮废水先进行稀释(Jungetal.,2004)和吹脱(王献平等,2007;陈莉荣等,2007),该工艺处理时间长,费用高(Yooetal.1999;Yangetal.2005).而正在研究中的同步硝化反硝化新工艺(SND)则在低氧条件下表现出较好效果,但出水中亚硝态氮含量可能偏高,反硝化作用也会因碳源不足而受限,很难保持处理过程连续稳定高效进行(吕锡武等,2002;张鹏等,2001;吕其军,2003).好氧反硝化细菌的发现,为污水生物脱氮技术注入了新的活力,对解决上述问题提供了新的方法.好氧反硝化细菌克服了传统的反硝化细菌只能在缺氧条件下进行反硝化作用的缺点,有氧生长,生长周期短,对高浓度的氮耐受力很强(Jooetal.,2005;周立祥等,2006),利于缩短废水脱氮时间,并为同步硝化反硝化作用的工程化提供了可能.但是现在发现的好氧反硝化细菌为数不多(王宏宇等,2007;黄运红等,2007;Patureauetal.,2000),而高效的好氧反硝化细菌则更少.为了更早地将好氧反硝化细菌应用于实际的高氮废水处理中,筛选分离出在更短时间内实现更高脱氮效率的好氧反硝化细菌以及对好氧反硝化的理论研究仍然是一项十分迫切的任务.基于好氧反硝化细菌多数是兼性细菌(Fretteetal.,1997;Paietal.,1999;Suetal.,2000),为此本研究分别以水稻土和活性污泥作为分离材料,筛选分离得到两株高效的兼性好氧反硝化菌,研究了其对高含氮人工配水中氮的脱除效率,以期为其工程应用提供科学依据.2材料和方法表面活性剂2.1好氧反硝化细菌的分离和澄清2.1.1微量元素和nh3.1分别在南京农业大学试验农场和南京锁金村污水处理厂取新鲜的淹水水稻土样10g和活性污泥样10mL,接种于装有90mL灭菌的反硝化培养液(g·L-1)(周立祥等,2006)(KNO32.0,柠檬酸钾钠11.4,MgSO4·7H2O0.2,KH2PO41.0,去离子水1L,pH7.0～7.5,2mL微量元素溶液(Jooetal.,2005)(EDTA·2Na57.1,ZnSO4·7H2O3.9,CaCl2·2H2O7.0,MnCl2·4H2O5.1,FeSO4·7H2O5.0,(NH4)6Mo7O24·4H2O1.1,CuSO4·5H2O1.6,CoCl2·6H2O1.6)的250mL磨口三角瓶中,振荡2h,待样品混匀后,添加培养液直至充满三角瓶为止,盖上瓶塞,并用石蜡-凡士林封口,28℃静置培养3d,取菌液5mL接种于新鲜反硝化培养液中,继续缺氧条件28℃静置培养3d,如此重复操作3次,以富集反硝化细菌.2.1.2菌株的培养和测定富集完成后,取1mL菌液稀释涂平板,28℃温箱培养3d,挑取形态不同的菌落进行分离纯化(56株).将分离纯化后的菌株接种于装有5mL的反硝化培养液的试管中,37℃,180r·min-1摇床振荡培养3d.吸取少量菌液,参照文献(李阜棣,1996),滴加格里斯试剂,二苯胺试剂和奈氏试剂,指示培养液中亚硝态氮、硝态氮、和氨态氮的变化.通过显色反应,挑选对硝态氮有较强利用效果的菌株接种于反硝化培养基斜面上,在4℃冰箱中保存.将保存在斜面上的菌株在平板(细菌培养基)上划线,挑取一环菌落至反硝化培养液中摇床振荡培养后,将2%(体积比)处于对数生长期的菌液接入100mL新鲜的灭菌反硝化培养液中,37℃,180r·min-1摇床振荡培养48h,培养期间采用称重法补充三角瓶中损失的水分.无菌操作,每12h取样2mL,除总氮测定外,培养液中其余氮素的浓度(硝态氮、亚硝态氮、氨态氮)以及总有机碳(TOC)浓度的变化测定均采用高速离心(12000r·min-1)培养液,去菌体取上清液的方法测定.2.2好氧反硝化细菌的鉴定2.2.1好氧反硝化细菌的生化特性参照文献(东秀珠等,2001),针对上述好氧反硝化作用明显的细菌进行形态特征和生理生化特征测定,包括对糖的发酵状况,对碳源的要求等,鉴定到属.采用半固体穿刺法检测细菌的需氧性和运动性.2.2.2tgactcag-31)目的菌株总DNA的提取参照文献(奥斯伯FM等,2005),从目的菌株中制备基因组DNA.2)目的菌株16SrDNA的PCR扩增及序列测定菌株的16SrDNA的PCR扩增测定参照参考文献(奥斯伯F.M.等,2005;Josephetal.,1989):以菌株的基因组DNA为模板,利用16SrDNA的通用引物:正向引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(Escherichiacolibases8to27);反向引物5’-TACCTTGTTACGACTT-3’(Escherichiacolibases1507to1492),构建20μL的反应体系(模板DNA1μL,dNTP(0.2mmol·L-1)2μL,引物(0.5μmol·L-1)各2μL,10×Buffer2μL,超纯水12μL,Taq酶(2.5U·μL-1)0.5μL).PCR反应条件:95℃预变性5min,进入热循环:94℃变性30s,53℃退火30s,72℃延伸1min,共30个循环.取PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳.采用PCR回收试剂盒回收纯化1.5kb左右的目的片段.纯化回收的PCR产物委托上海博亚生物公司测序.3)目的菌株系统发育地位的确定和系统发育关系研究挑选数据库中同源性相近的15株细菌的16SrDNA序列系统用于进化发育学分析,用MEGAversion3软件包中的Kimura2-ParameterDistance模型计算进化距离,用Neighbor-Joining构建系统进化树,1000次随机抽样,计算自引导值(Bootstrap)以估计系统进化树的置信度.2.3细菌计数和理化指标总氮测定采用GB11894-89过硫酸钾氧化紫外分光光度法,氨氮测定采用GB7479-87纳氏试剂分光光度法,硝氮采用GB7480-87酚二磺酸紫外分光光度法测定,亚硝氮测定采用GB7493-87N-(1-奈基)-乙二胺分光光度法.细菌计数采用稀释平板计数法(沈萍等,1998).水中溶解性总有机碳TOC采用总碳分析仪(TOC-5000A,SHIMADZU)测定.3结果结果3.1菌株的形态和生理生化特性结合平板上的菌落形态和镜检结果,并用显色剂检测最终得到2株效果最好的兼性好氧反硝化菌株,编号ZW23和ZW27.菌株ZW23和ZW27在平板上培养3d后,形成直径3～5mm的圆形菌落,菌落表面光滑,隆起,呈淡黄色.菌体形态见图1,菌株ZW23和ZW27的单细胞呈杆状,大小分别是(0.50～0.60)μm×(1.00～1.50)μm和(0.35～0.60)μm×(0.80～1.20)μm.革兰氏阴性,无芽孢和荚膜.采用半固体穿刺法对其需氧和运动性测定发现,两株菌株都沿着穿刺线自上而下穿透培养基扩散生长,表明两株菌都是兼性菌.按照文献(东秀珠等,2001),对菌株ZW23和ZW27进行生理生化鉴定,特征见表1.根据形态学和生理生化特征测定结果,初步鉴定菌株ZW23和ZW27是假单胞菌属(Pseudomonas).3.2有关目的植物的生物学特性3.2.1pcr扩增检测图2为目的菌株总DNA电泳结果图.用菌株ZW23和ZW27的基因组DNA作模板,利用16SrDNA通用引物进行PCR扩增,得到长约1.5kb的目的片段,扩增结果见图3.3.2.2菌株与假单胞菌属和门多萨菌的相似性分析选取GenBank数据库中15株同源性相近的细菌与ZW23和ZW27一起构建系统进化树,结果见图4和图5.从进化树上可明显看出,菌株ZW23和ZW27分别与假单胞菌属(Pseudomonas)中的类产碱杆菌(pseudoalcaligenes)和门多萨菌(mendocina)相似性最高,同源性达到99%,所以菌株ZW23是假单胞菌属类产碱杆菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)的一种,菌株ZW27是假单胞菌属门多萨菌(Pseudomonasmendocina)的一种.3.3生物活性成分的降解在接种菌株ZW23和ZW27的培养液中氮素形态和浓度的变化结果见图6.由图6中看出,在没有接入细菌的对照反硝化培养液(CK)中总氮含量在48h内均没有变化,表明在培养液中的NO-3没有发生化学反硝化.而在接有细菌ZW23和ZW27的培养液中,经测定,初始的12h内菌株呈现指数生长,在24h时细菌数量达到109个·mL-1.对应地,培养液中总氮(TN)显著下降,在6h内,培养液中总氮均降低了128.82mg·L-1和78.28mg·L-1,TN削减率分别为45.53%和27.76%.6至12h,培养液中总氮浓度依然持续下降,接种ZW23和ZW27的培养液中TN含量分别减少187.95mg·L-1和185.43mg·L-1,削减率分别达66.43%和65.54%.由于TN测定中包含了微生物同化的氮,因此,TN的减少主要源于微生物好氧反硝化作用所致,在本研究中总氮的减少程度即代表了反硝化脱氮的效果.从图6中还可看出,12h后培养液中NO-3-N浓度降至20mg·L-1,脱氮速率分别达到约21.72mg·L-1·h-1和22.31mg·L-1·h-1,48h时NO-3-N的利用率分别达到约98.12%和99.68%.反应过程中没有NO-2-N和NH+4-N的积累,培养液中其余33.58%(ZW23处理)和34.46%(ZW27处理)的TN则主要被转化为微生物氮.由此推测,碳源提供的电子供体,一部分经由电子传递链传递给氧,同时释放能量,利用NO-3-N作为生物合成的氮源,细胞增殖.而另一部分电子则传递给NO-3-N,好氧条件下进行反硝化作用,引起体系总氮下降.值得注意的是,在两株菌进行好氧反硝化的同时,它们对培养液中有机碳源的消耗与利用也十分明显(见图6).在12h内,初始浓度2756mg·L-1的总有机碳(TOC)分别减少50.66%和52.74%,36h内,消耗率约90%,减少的有机碳浓度约2500mgC·L-1.TOC的减少一方面是由于部分有机物被微生物分解而提供能量,另一方面,部分有机物被微生物利用合成了新的细胞物质所致.目前,已报道分离出的好氧反硝化菌其脱氮速率大多数在4.50～13.67mg·L-1·h-1(Patureauetal.,2000;黄运红等,2007;Paietal.,1999;Suetal.,2001;马放等,2005).而本试验分离出的两株菌其脱氮速率是这些菌的1.60～4.89倍.由此可见,菌株ZW23和ZW27对溶液中高浓度的氮和有机碳的这种影响对水处理工程中氮和COD的去除有十分重要的意义.因为大部分氮可在短时间内(12h内)通过反硝化去除,而剩下的氮和COD还可通过微生物利用加速其增殖后再通过二次沉淀池分离活性污泥而去除.4胞菌的分离和碳源的利用1)分别从淹水水稻土和活性污泥中分离到兼性好氧反硝化细菌菌株ZW23和ZW27,经鉴定两株细菌分别是假单胞菌属类产碱杆菌Pseudomonaspseudoalcaligenes和假单胞菌属门多