外周血松胞素阻滞微核法预测鼻咽癌放射敏感性的前瞻性研究

外周血松胞素阻滞微核法预测鼻咽癌放射敏感性的前瞻性研究

采用松细胞肺癌包裹微核法（cbnna）测定第一次细胞分裂时产生的两个细胞及其中间微核，以反映染色体碎片或缺失的情况。我们用外周血淋巴细胞CBMNA前瞻性研究微核率及微核细胞率与放射治疗急性反应、50Gy鼻咽肿瘤消退率、放疗后3个月肿瘤射野内消退状况等,探讨CBMNA的微核率、微核细胞率预测鼻咽癌正常组织放射敏感性及肿瘤组织放疗反应的可行性。材料和方法1.药品、动物血凝素等f4-1、3ga松胞素B、吉姆萨粉为美国Sigma公司产品,胎牛血清为杭州四季青公司产品,植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)为广州市医药工业研究所产品,F34-1型深部X线机由北京东方红医疗器械厂生产。2.纳入及排除标准入组标准:(1)初治原发鼻咽癌患者,活检为鼻咽未分化型非角化性癌(WHO),无远处转移,Karnofsky评分80分以上;(2)放疗期间接受单纯根治性放疗;(3)愿意接受本课题要求的3次外周血检查、鼻咽和或颈MRI检查,签署知情同意协议者;(4)由我科报务台安排给本研究的连续钴机放疗的患者。排除标准:(1)放疗期间出现远处转移,中止放疗者;(2)未能按本课题要求完成3次外周血检查、MRI检查;(3)放疗期间除根治性放疗外,又行其他抗癌治疗者。2005年9月23日至2006年3月17日共有46例患者进入本研究,1例放疗期间出现骨转移,1例放疗期间颈部淋巴结增大,科内会诊要求加同期化疗及热疗增敏,2例因经济原因拒绝行第三次MRI复查,此4例排除出本研究,共有42例进入总结。男32例,女10例。年龄21～74岁,平均(46.83±12.64)岁。有烟瘾者26例,无烟瘾者16例。T分期:T1期2例,T2期13例,T3期20例,T4期7例。N分期:N0期6例,N1期22例,N2期13例,N3期1例。Ⅰ期2例,Ⅱ期10例,Ⅲ期23例,Ⅳ期7例。3.患者临床检查治疗方案按我科鼻咽癌治疗规范,T4、N2、N3患者放疗前诱导化疗1～2疗程,PF方案:DDP20mg/m2,d1～d5;5-Fu500mg/m2,d1～5。外照射时除颈后电子线照射用直线加速器外,余射野均用钴机,每野次剂量200cGy,第一段面颈联合野+下颈前野36Gy;第二段加量至60Gy,若咽后肿大淋巴结达口咽平面或颈部淋巴结大、靠近乳突者,两侧行钴机后界前移的面颈联合野,颈后野用直线加速器电子线照射淋巴结区,其他患者用钴机面颈分野;第三段外照射60Gy后加量,T1、无咽后肿大淋巴结的T2期患者,加鼻咽后装近距离照射,双气囊施源器,每气囊充气量3ml,源外1cm5Gy/次,治疗活性长度1cm,共3次。余患者行缩小的耳前野加量至70Gy,若颅底肿瘤破坏明显者,加颅底小野6Gy。颈淋巴结区预防剂量50Gy,肿大淋巴结区加量至60～70Gy。本组病例中9例行2程、6例行1程PF化疗,化疗后2～4周始行根治性放疗;2例T1、5例T2患者在外照射60Gy后加鼻咽后装放疗15Gy,余35例患者行常规外照射,8例行颈后电子线照射,鼻咽剂量70～76Gy,颈部剂量50～70Gy。放疗前常规检查鼻咽MRI和(或)颈部MRI;外照射50Gy、放疗结束后3个月复查鼻咽MRI检查和(或)颈部B超或颈部CT/MRI检查。外照射前、20Gy、60Gy时分别用肝素抗凝管抽取静脉血3ml。每周2次临床检查,记录患者皮肤、口咽黏膜RTOG/EORTC急性放射并发症Ⅱ级初始出现时的外照射剂量。RTOG/EORTC急性放射并发症Ⅱ级标准如下:(1)皮肤:明显红斑/斑点状湿性脱皮,中度水肿;(2)黏膜:斑点状黏膜炎伴浆液性渗出,中度疼痛,需用止痛药。4.小鼠骨髓细胞微核试验(1)取血标本:每一例患者外照射前、20、60Gy时用肝素抗凝管分别抽取静脉血3ml。在超净工作台上吸取血标本0.4ml加入预装有4.6ml20%胎牛血清1640PHA培养液西林瓶中。(2)深部X线机照射:外照射前的血标本分装成5份,分别在深部X线机下照射0,0.5,1,2,4Gy,条件:210kV,12mA,0.52mmCu,剂量率96.6cGy/min,限光筒大小:10cm×15cm,把需照射区域置于射野中心。(3)血标本培养:X线机照射完后的血标本、20Gy、60Gy时抽取的血标本放入37℃、5%CO2细胞培养箱培养。44h后加入松胞素B,终浓度为6μg/ml,摇匀后放入培养箱,72h终止培养。(4)低渗、固定、制片:用吸管小心吸去上清液,加入0.075molKCl低渗液5ml,吹打混匀后,倒入10ml离心管,在37℃水浴箱恒温5min,加入5∶1甲醇∶丙醋酸2ml预固定,吹打均匀,22℃室温静置10min,1500r/min离心10min,吸去上清液,再加入5∶1甲醇∶丙醋酸5ml,吹打均匀,室温静置20min,1500r/min离心10min,吸去上清液,最后加入5∶1甲醇∶丙醋酸5ml,吹打均匀,室温静置20min,1500r/min离心10min,吸去上清液,使试管内液体残留至0.4ml,吹打混匀后,取出预置于-20℃冰箱内的病理玻片,每片滴3～4滴,空气干燥。(5)染色、阅片、计数双核细胞微核率及微核细胞率:用新鲜配制的10%吉姆萨工作液30ml倒入染色盒内,染色20min。按Fenech计数淋巴细胞微核的方法进行计数。微核的标准为:位于主核大小一致的双核细胞胞浆内,核膜独立或条带(核浆桥)相连;微核直径是主核的1/16～1/3;圆形或卵圆形,染色与主核相同,可与主核分开;无折光性,可与伪影分开。在1000倍油镜下观察,每张玻片计数1000个双核细胞,全片若不够1000个双核细胞,则按实际片上所有的双核细胞计数,计数双核细胞微核率及微核细胞率。5.y时截面积高黎等报道,50Gy鼻咽肿瘤组织消退率(decreasedarearateatthedose50Gy,dA50)=(0Gy时截面积-50Gy时截面积)/0Gy时截面积,0Gy截面积指在放疗前增强MRI横断面、矢状面或冠状面上最大横径A与其垂直径B乘积,50Gy时截面积指与0Gy相应层面上的横径与其垂直径乘积。放疗前肿瘤体积指0Gy时截面积×C,若截面积取自横断面,则C指矢状面或冠状面上最大上下径;若截面积取自矢状面,则C指横断面上最大左右径;若截面积取自冠状面,则C指横断面上最大前后径。6.统计学分析用SPSS11.0统计软件行结果分析。两组资料比较采用t检验,列联表计数资料采用crosstabpearson卡方检验。指标间分析采用相关分析及偏相关分析。P<0.05为有统计学意义。结果1.级反应的初始剂量的确定出现皮肤RTOG/EORTCⅡ级反应的初始剂量为(52.36±10.37)Gy,中位剂量52Gy,口腔黏膜RTOG/EORTCⅡ级反应的初始剂量为(45.31±15.76)Gy,中位剂量48Gy,皮肤Ⅱ级反应的初始剂量与黏膜Ⅱ级反应的初始剂量有明显的相关性(γ=0.542,P=0.000)。因各个体射野内皮肤、黏膜受量可达到50Gy,定义等于或低于处方剂量50Gy外照射时出现皮肤或黏膜RTOG/EORTCⅡ级反应者为放疗急性反应敏感组(25例),反之为放疗急性反应不敏感组(17例),分两组资料进行统计分析。2.病例全消率统计鼻咽癌患者在放疗后3个月经临床检查、B超、CT/MRI检查发现鼻咽或颈部肿瘤病灶,并经鼻咽镜活检或颈淋巴结活检确诊癌细胞残存者,定义为残留组,其他为局控组。本组病例放疗后3个月鼻咽、颈部病灶全消率34/42(80.9%)。局控组34例,残留组8例,分成两组进行统计分析。相关分析发现,急性反应敏感与肿瘤局控呈明显正相关(r=0.465,P=0.002)。3.体外照射mrcf的实验结果双核细胞微核率(MNF)在X线照射0,0.5,1,2,4Gy和体外照射20Gy、60Gy时分别为0.0147±0.0115、0.0401±0.0164、0.0853±0.0314、0.2274±0.0745、0.5321±0.1573、0.1254±0.0246和0.1689±0.0392。双核细胞微核细胞率MNCF在X线照射0,0.5,1,2,4Gy,体外照射20Gy、60Gy时分别为0.0136±0.0099、0.0346±0.0149、0.0773±0.0295、0.2113±0.0699、0.4951±0.1514、0.1171±0.0238、0.1575±0.0360;随剂量增加,MNF及MNCF均明显增加(P=0.000)。淋巴细胞微核见图1,2。4.最大截面积肿瘤退行性实验放疗前MRI检查:鼻咽肿瘤体积(49.58±51.59)cm3,0,50Gy时最大截面积分别为(12.38±9.07)cm2和(4.54±5.49)cm2,肿瘤消退率为0.6865±0.2226(图3,4)。5.正常组织急性反应、化疗及放疗特征与肿瘤局控的关系正常组织急性反应、肿瘤近期消退状况与MNF、MNCF的关系见表1,2。由表1可见,在体外照射1Gy及以上剂量、20Gy、60Gy时外周血微核率在放射敏感组明显比不敏感组增加(P<0.01),但在放疗前自发性微核率、0.5Gy小剂量照射下诱发的微核率在两组间差异无显著性。在体外照射2Gy及以上剂量、20Gy、60Gy时外周血微核率在肿瘤局控组比残留组明显增加(P<0.05),但在放疗前自发性微核率、0.5Gy及1Gy小剂量照射下诱发的微核率在两组间差异无显著性。由表2可见,在体外照射1Gy及以上剂量、20Gy、60Gy时外周血微核细胞率在放射敏感组明显比不敏感组增加(P<0.01),但在放疗前自发性微核率、0.5Gy小剂量照射下诱发的微核率两组间差异无显著性。在体外照射2Gy及以上剂量时、60Gy时肿瘤局控组外周血微核细胞率比残留组明显增加(P<0.05),但在放疗前自发性微核率、0.5Gy及1Gy小剂量照射下诱发的微核率两组间差异无显著性。正常组织急性反应、肿瘤近期消退状况与分期、化疗、放疗前体积、50Gy肿瘤消退率、年龄、性别之间的关系见表3。从表3可以看出,皮肤、黏膜放射敏感组年龄明显较不敏感组大(P=0.039)。化疗疗程少者似乎更敏感,这不符合常理。由于是否化疗取决于T、N分期,T4、N2、N3者行诱导化疗,因此化疗是非独立因素。行偏相关分析发现,在控制T、N的情况下,化疗与肿瘤放疗反应的偏相关系数为-0.2651,P=0.098,两者无明显相关性。肿瘤总分期、T、N分期、放疗前肿瘤体积、50Gy肿瘤消退率、性别在皮肤、黏膜放射敏感组与不敏感组间比较,差异无显著性。局控组50Gy肿瘤消退率明显比残留组更大,局控组年龄也明显比残留组更大。化疗疗程越少者似乎局控率更高,这不符合常理。考虑到T4、N2、N3者行诱导化疗,化疗与T、N分期有关,是非独立因素,行偏相关分析,在控制T、N后,化疗与肿瘤局控的偏相关系数-0.2601,P=0.105;控制化疗因素后,N与肿瘤局控的偏相关系数-0.2149,P=0.177;可见在本组病例中,N分期、化疗疗程数与放疗后3个月肿瘤局控无相关性。肿瘤总分期、T分期、放疗前肿瘤体积、性别在肿瘤组织局控组与残留组间比较,差异无显著性。6.肿瘤刑事计划微核率与肿瘤各功能间的相互作用性别、年龄、总分期、化疗、放疗前肿瘤体积、50Gy肿瘤消退率、2Gy时微核率的相互关系见表4。从表4可以看出,分期与化疗(r=0.539)、分期与肿瘤体积(r=0.403)呈明显正相关,余因素间无相关性。外周血淋巴细胞放疗后微核试验及适应证Fenech等、Lee等指出,选择外周血淋巴细胞辐射损伤检测有以下优点:(1)为放射敏感细胞,可被小剂量射线损伤,而其他体细胞敏感性较差;(2)外周血淋巴细胞持续全身循环,可通过放射野,可作全身射线吸收剂量的生物剂量仪;(3)体外试验时放射反应及放射防护剂效应与体内试验时高度一致;(4)易于获取,在促有丝分裂剂植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)刺激下从G0期转化成M期,表达出染色体的损伤;(5)敏感性好,可检测出5cGy剂量差异;⑹染色体损伤后数月甚至数年仍可通过外周血CBMNA检测到。因此,在检测正常组织放射损伤、放射防护剂、放射增敏剂、致DNA或染色体损伤的化学物质效应等方面,国内外大多数实验室行松胞素阻滞微核法检测时均采用外周血淋巴细胞,本课题也不例外。Odagiri等对124例志愿者外周血照射0Gy、2Gy后行CBMNA检测微核率,发现0Gy时变异不大,但2Gy照射后,微核率差异明显,与年龄、性别无相关性,与个体的内在放射敏感性相关。Cao等对9例单纯放射治疗的鼻咽癌患者外照射0,4,10,28,48,68Gy时抽外周血检测,发现CBMNA是最敏感检测方法,优于彗星法及染色体畸变法,在外照射4Gy时外周血微核率即增高,28Gy时明显增高,推荐外周血CBMNA为检测放射后染色体损伤的首选方法。Lee等对38例前列腺癌患者检测外周血CBMNA微核率,随访(32.8±4.6)个月,发现直肠反应Ⅰ级及以下者25例,Ⅱ级及以上者13例,微核率在照射1Gy时即有差异,2Gy以上时有明显差异,提示放疗前CBMNA微核率可预测前列腺癌患者放射治疗后正常组织放