丁香油体外抗MRSA作用研究

I题目：丁香油体外抗MRSA作用研究目录中文摘要17431_WPSOffice_Level1 Ⅰ8001_WPSOffice_Level1英文摘要 Ⅱ16430_WPSOffice_Level1前言 119896_WPSOffice_Level11实验材料 124017_WPSOffice_Level21.1菌株 120893_WPSOffice_Level21.2药物 212388_WPSOffice_Level21.3主要试剂 212859_WPSOffice_Level12实验方法 211295_WPSOffice_Level22.1菌液制备 229294_WPSOffice_Level22.2药液制备 211518_WPSOffice_Level22.3丁香油抗MRSA体外活性 26278_WPSOffice_Level32.3.1MIC测定 231028_WPSOffice_Level32.3.2FIC测定 320102_WPSOffice_Level32.3.3数据统计分析 31259_WPSOffice_Level22.4丁香油对MRSA生长的影响 310589_WPSOffice_Level32.4.1丁香油对MRSA生长的影响 325882_WPSOffice_Level32.4.2丁香油与头孢氨苄联合使用对MRSA生长的影响 330427_WPSOffice_Level13结果与分析 329212_WPSOffice_Level23.1丁香油抗MRSA体外活性 324554_WPSOffice_Level23.2丁香油与β-内酰胺类抗生素联合使用抗MRSA活性 424877_WPSOffice_Level23.3丁香油对MRSA生长的影响 4287_WPSOffice_Level23.4丁香油与头孢氨苄联合使用对MRSA生长的影响 532459_WPSOffice_Level14讨论 621300_WPSOffice_Level1结论 631710_WPSOffice_Level1参考文献 79629_WPSOffice_Level1致谢 915578_WPSOffice_Level1诚信声明 9Invitroanti-MRSAeffectofcloveoilagainstmethicillin-resistantStaphylococcusaureusAbstractObjective:Tostudytheanti-MRSAactivityofcloveoilinvitroandtheanti-MRSAinvitrowiththreeantibiotics(amoxicillin,cephalexinandcefepime),whichlaysafoundationforthedevelopmentofnewdrugsforpreventionandtreatmentofMRSAinfection.Methods:96-wellplatemicrodilutionmethodwasusedtodeterminetheMICofcloveoilandcloveoiltogetherwith3antibioticsfor2MRSAstandardstrainsand32MRSAclinicalisolates.The96-wellplatemicro-checkerboardmethodwasusedtodeterminecloveoil.FICindexwith3antibiotics;growthcurveanalysisofcloveoil,andtheeffectofcloveoilandcephalexinonthegrowthofMRSA.Results:CloveoilwasresistanttoMRSAinfectioninvitrowithanMICof0.25mg/mLto0.51mg/mL.Whencloveoilisusedtogetherwiththreekindsofantibiotics,thegradinginhibitionindexisconcentratedin≤0.5and0.5～1,andcephalosporinTheampicillinsynergyratewas97.0%,thesynergisticratewithcefepimewas64.7%,andtheamoxicillinsynergyratewas58.8%.Cloveoilcansignificantlyenhancetheanti-MRSAactivityofthesethreeantibiotics,reducetheuseofantibiotics,andmakeMIC50andTheMIC90isreducedto1/4~1/2and1/2~1ofthedrugalone.ThegrowthcurveshowedthatcloveoilcansignificantlyincreasetheMRSAlagphase,reduceitsgrowthrate,significantlyreduceitsgrowth,andinhibitthegrowthofMRSAinadose-effectrelationship;whencloveoil(1/4MIC)andcephalexinAfteracombinationof(1/4MIC),MRSAgrowthwasalmostinhibited.Conclusion:Cloveoilnotonlyhasstronganti-MRSAactivity,butalsostrengthenstheanti-MRSAeffectofβ-lactamantibioticswhenusedtogether.Itisexpectedtoprovidenewresearchideasforthepreventionandtreatmentofmultidrug-resistantbacteriabytraditionaldrugs.KeywordsCloveoil;methicillin-resistantStaphylococcusaureus;antibacterialactivityinvitro;Synergyaction;β-lactamAntibiotics成都医学院学士学位论文（设计）PAGEPAGE9前言世界上首株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)在1961年所检出报道[1]。MRSA是目前引起医院感染的首要病原菌，有着高分离率、耐药性强、和感染后易死亡的特征。其感染后的死亡率比结核、流行性感冒、病毒性肝炎和HIV感染死亡比例均高，与其感染死亡率的总和一致或更高。由于这些特征，对临床治疗加大难度，威胁着人类健康[2-4]。随着临床一线药物（万古霉素和利奈唑胺）的广泛使用[5,6]，以及一线药物具有明显的毒副作用，导致MRSA感染面临着用药难和难用药的现实处境。因此,研究新的抗MRSA的药物是具有重要的临床意义的[7-9]。中药作为我国的传统药，具有广谱抗菌、增强身体免疫力等广泛药理活性、长期使用后其耐药性小等特点[10-13]。丁香（clove）属木樨科丁香属（Syringa），丁香的种植历史悠久，资源丰富[14]。挥发油是丁香发挥药物作用的物质基础[15]，大部分报道均检测到挥发油中含量最高的化学成分丁香酚，丁香酚（C10H10O2）是一个苯环第四位碳原子被烯丙基链取代的苯酚[16]。曾荣等[16]发现丁香精油具有广谱抗细菌真菌的作用，丁香酚对革兰阴性杆菌的抑制效果优于丁香油。前期研究发现，丁香油具有防止氧化[17]、防止细菌[18]等作用，且本身具有浓郁的香气，作为食品添加剂、保鲜剂被应用于食品行业[19]。丁香油除上述应用外，具有降低炎性反应[17,20]、镇痛[21]、清除氧自由基[22]、治疗心脑血管系统[23]和消化系统[24]等疾病等作用，为传统药物控制细菌耐药性，防治多重耐药菌感染提供新的研究方向，有望开发成为新的临床用药。1实验材料1.1菌株MRSA标准株：ATCC33591和ATCC43300，购自美国典型培养物保存中心；MRSA临床分离株：来源于四川省妇女儿童医院的32株菌，经头孢西丁抗菌药物敏感试验和mecA基因鉴定为MRSA，菌株来源和编号见表1。表1：受试菌株的编号和来源Tab.1：Numberandsourceofexperimentalbacteria序号菌株编号菌种名称来源1ATCC43300MRSA标准株美国典型菌种保藏中心2ATCC33591MRSA标准株美国典型菌种保藏中心3855MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院4879MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院5906MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院6913MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院7942MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院8955MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院91001MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院101013MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院111014MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院121031MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院131088MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院141102MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院151144MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院161155MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院171156MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院181158MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院191166MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院201180MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院211239MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院221248MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院231392MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院241412MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院254837MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院267007MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院277017MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院287020MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院297029MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院308274MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院318305MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院328306MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院338318MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院348325MRSA临床分离株四川省妇女儿童医院1.2药物丁香油购自北京同仁堂，密度(ρ=652.8mg/mL)；头孢氨苄(Cephalexinmonohydrate)，批号C7910；阿莫西林(Amoxicillinhydrochloridetrihydrate)，批号N8350，头孢吡肟(Cefepime)，批号L8730；均购自罗恩公司。1.3主要试剂Muller-HintonBroth(MHB)，批号M8556；0.5麦氏比浊管；96-孔板，批号TCP-010-096；Tween-80，批号20170425；营养琼脂，批号N8590；氯化钠，批号R019772；均购自罗恩公司。2实验方法2.1菌液制备从-80℃冰箱取出各待测菌，蘸取菌液于琼脂平板四区划线，37℃活化，将单个菌落置于生理盐水（0.9%）中，将菌液浓度调为0.5个麦氏浓度（1.5×108CFU/ml）。2.2药液制备用Tween-80对丁香油乳化，制备成初浓度为130.56mg/mL丁香乳化液，并存储在4℃冰箱备用。用无菌水配制抗生素为4096μg/mL的储存液，4℃冰箱备用。将丁香油乳液和抗生素储存液通过二倍稀释法稀释，稀释成12种不同浓度梯度的稀释液用于测定最低抑菌浓度（minimuminhibitoryconcentration,MIC）和分级抑菌浓度（fractionalinhibitoryconcentration,FIC）。2.3丁香油抗MRSA体外活性2.3.1MIC测定采用微量稀释法测定丁香油、阿莫西林、头孢氨苄和头孢吡肟的MIC值[26]。具体操作如下：将MHB培养液、稀释药液和菌液依次加入96孔板，使丁香油在每孔中的终浓度为0.02mg/mL-32.64mg/mL，抗生素的终浓度为1μg/mL-2048μg/mL，并在37℃培养18h-24h，观察待测菌的生长情况。以待测菌未生长的孔的药物浓度为该细菌的MIC值。只含有培养液的孔为空白对照，溶剂代替药物为阳性对照，仅含药物为阴性对照。每株待测菌进行3个平行实验，每次实验重复3次。2.3.2FIC测定由已经得到的丁香油（A药）和三种抗生素（B药）的MIC值，采用96微孔板棋盘法测定A药与B药一起使用时的FIC值。具体操作如下具体方法如下：将A药和B药分别依次稀释使其终浓度为1/16MIC~2MIC，将配制保存的A药和B药按照棋盘法设计，在96孔板依次加入A药、B药和待测菌液，培养条件同上。FIC值的判定方法同上[27]，对照同上。2.3.3数据统计分析MIC50（MIC90）分析：MIC50（MIC90）为使50%（90%）待测菌株不生长所需的最小药物浓度。FIC指数分析[28]：FIC=A联用MIC/A单用MIC+B联用MIC/B单用MIC。结果判断[28]：FIC>2为拮抗作用,1<FIC≤2为无关作用,0.5<FIC≤1为相加作用，FIC≤0.5为协同作用。2.4丁香油对MRSA生长的影响2.4.1丁香油对MRSA生长的影响如2.1所述配制0.5个麦氏浓度的ATCC43300菌液，以1%细菌量加入MHB培养液中，分为以下5组：3/4MIC丁香油处理组、1/2MIC丁香油处理组、1/4MIC丁香油处理组、1/8MIC丁香油处理组和空白对照；在37℃恒温培养24h，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h取样，用多功能酶标仪读取OD600值，绘制MRSA生长曲线图。2.4.2丁香油与头孢氨苄联合使用对MRSA生长的影响菌液配制同上，以1%的接种量加入MHB培养液中，分为1/4MIC（62.5μg/ml）丁香油处理组、1/4MIC（4μg/ml）头孢氨苄处理组、1/4MIC丁香+1/4MIC头孢氨苄处理组、空白对照组共4个组，测定方法同上。3结果与分析3.1丁香油抗MRSA体外活性采用微量稀释法测定了丁香油和三种抗生素的MIC值，结果见图1。由图1可知，MRSA临床菌株对这三种抗生素表现为多重高水平耐药，MIC值为4μg/mL～1024μg/mL。而丁香油MIC值为0.25mg/mL～0.51mg/mL。图1：丁香油和β-内酰胺类抗生素的MIC值分布Fig.1：ThedistributionoftheMICsofcloveoilandthreekindsofβ-lactamantibiotics3.2丁香油与β-内酰胺类抗生素联合使用抗MRSA活性测定了丁香油与三种抗生素一起使用时的MIC值和对2株MRSA标准株的活性影响变化，结果见表2和表3。表2：丁香油与抗生素联合使用对MRSA的MIC比较分析Tab.2：MICcomparativeanalysisofcloveoilcombinedwithantibioticsagainstMRSA药物ATCC33591ATCC43300单用MIC与丁香油联合使用MIC单用MIC与丁香油联合使用MIC阿莫西林8244头孢氨苄168168头孢吡肟841288由表2可知，丁香油与3种抗生素一起使用时，能明显降低测定的3种抗生素对MRSA的MIC，说明丁香油能有效增强β-内酰胺类抗生素的抗MRSA活性，可以降低抗生素的使用量，减低这两株MRSA标准株的耐药作用。表3：丁香油与抗生素联合使用对MRSAMIC50和MIC90的影响Tab.3：MIC50andMIC90ofantibioticscombinedwithcloveoilagainstMRSA药物单用与丁香油联合使用MIC50MIC90MIC50MIC90阿莫西林641281664头孢氨苄2561024128512头孢吡肟25651264512由表3可知，三种抗生素与丁香油一起使用，其对MRSA的MIC50和MIC90有不同程度的降低。其中阿莫西林和头孢吡肟的MIC50降低最大，为单独用药时1/4；除头孢吡肟的MIC90无变化，其余抗生素MIC90降低为单独用药1/4，说明丁香油可有效降低这三种抗生素抗MRSA的用量。统计分析了丁香油和三种抗生素一起使用时对34株MRSA待测菌的相互作用，结果见表4。表4：丁香油与抗生素联合使用的FIC指数分析Tab.4：FICindexdistributionofcloveoilcombinedwithantibioticsagainstMRSA药物FIC≤0.50.5﹤FIC≤11﹤FIC≤2FIC>2协同作用相加作用无关作用拮抗作用丁香油+阿莫西林20（58.8%）8（23.5%）6（17.7%）0丁香油+头孢氨苄33（97.0%）1（3.0%）00丁香油+头孢吡肟22（64.7%）5（14.7%）7（20.6%）0由表4可知，丁香油与三种抗生素一起使用，FIC指数集中分布在≤0.5和0.5～1，表明主要呈协同作用（58.8%-97.0%），不同抗生素协同率略有不同，但所有抗生素均没有拮抗作用。说明丁香油可有效加强这三种类抗生素的抗MRSA作用，减低MRSA对这三种抗生素的耐药作用。3.3丁香油对MRSA生长的影响采用生长曲线法分析了不同剂量的丁香油对MRSA生长的影响，结果见图2。图2：丁香油对MRSA生长的影响(±s,n=3)竖线表示标准差Fig.2：ThegrowthcurveofMRSAtreatedwithcloveoil(±s,n=3)由图2可知，丁香油处理MRSA标准株ATCC43300，其生长受到明显抑制，随着药物浓度增加，菌体生长速度明显降低，同时菌体生长量也随之明显下降，说明其抑制效果与药物浓度呈明显正相关。其中1/8MIC丁香油与1/4MIC丁香油对MRSA抑制效果不明显，1/2MIC丁香油较对照组延长迟缓期2h进入对数期，而3/4MIC丁香油能明显延长MRSA迟缓期，细菌延迟16h进入对数期，MRSA生长几乎被抑制。说明丁香油抑制MRSA生长呈明显量效关系。3.4丁香油与头孢氨苄联合使用对MRSA生长的影响采用生长曲线法测定了丁香油和头孢氨苄联合使用对MRSA标准株ATCC43300生长的影响。结果见图3。图3：丁香油与头孢氨苄联合使用对MRSA生长的影响(±s,n=3)竖线表示标准差Fig.3：ThegrowthcurveofMRSAtreatedwithcloveoilandcefalexin(±s,n=3)由图3可知，只加待测菌液的空白对照组，MRSA4h开始进入对数生长期，14h进入平稳期；经1/4MIC头孢氨苄处理后，MRSA生长受到一定程度抑制，迟缓期稍微延长，菌液生长总量较空白组稍微下降；经1/4MIC丁香油处理后，MRSA生长总体影响较小；但同时经1/4MIC丁香油和1/4MIC头孢氨苄联合处理后，MRSA生长受到显著抑制，24h内未见MRSA明显生长，生长几乎处于抑制状态。说明丁香油能显著够增强头孢氨苄抗MRSA活性。4讨论丁香是我国常见的传统中药和名贵香料，在我国有着悠久的种植和使用历史，在食品和和医药方面有着广泛的应用市场。丁香为温性树种，主要种植于热带地方，如坦桑尼亚，我国云南等地也陆续栽种。丁香油作为纯天然无毒无害的天然产物，具有镇痛、抗细胞氧化、杀细菌、抗病毒、杀真菌、降低炎症反应、加强身体免疫力等作用[29]。本文在前期丁香油自身抗菌活性研究的基础上，深入探讨丁香油与临床最常用的β-内酰胺类抗生素联合使用抗临床“超级细菌”MRSA作用，解决目前抗MRSA感染用药难和难用药的现状。在指导MRSA感染控制及新药研发方面具有重要的理论和现实意义。丁香油作为一种天然提取物，被广泛用于食品工业保鲜[19]。曾荣等[14]采用结合杯碟法和双层平板法测定丁香对受试菌（主要为引起食物腐败的细菌）的抑制作用，发现丁香精油和丁香酚有广谱的抗菌活性，丁香酚对革兰阴性杆菌效果优于丁香精油。丁香酚是许多国家都同意使用的食品添加剂，关于丁香油的研究，主要报道其对食品腐败菌的体外抗菌活性研究[30]。目前，未报道丁香油抗MRSA作用研究。本研究以临床分离的MRSA多重耐药菌株为研究对象，分别分析了丁香油自身抗MRSA活性，以及丁香油与以头孢氨苄为代表的3种抗生素对MRSA生长的影响。结果表明，丁香油对MRSA有体外抗菌作用，提示丁香油可用于临床MRSA感染的防治；联合实验发现，丁香油与3种抗生素共同使用时以协同作用(58.8%~97.0%)为主；再者测定为相加作用(3.00%~23.5%)；其中与头孢氨苄联合使用的效果最好，协同率为97%。提示丁香油可与β-内酰胺类抗生素共同使用，可加强抗生素临床治疗MRSA的效果，降低药物用量。而丁香油如何在体内抗MRSA感染，及与抗生素一起使用时的抗MRSA感染的疗效如何？丁香油是否具有增强喹诺酮类等其他抗生素的体外活性？有待后续深入研究。通过分析不同浓度丁香油对MRSA的生长抑制作用，以及丁香油与头孢氨苄的联合用药对MRSA生长曲线的影响，发现丁香油自身对MRSA生长的作用呈明显浓度依赖性，当与头孢氨苄联合使用时，两者均只需要单用时1/4的浓度，MRSA的生长几乎被完全抑制，与体外活性的协同增效作用结果一致。初步的丁香油抗MRSA作用机制分析发现，丁香油能明显延长MRSA的延滞期，降低细菌生长量，但其具体的抗菌机制是否通过影响胞膜渗透性、影响核酸代谢和抑制细菌细胞壁合成等[31-32]，有待于后续深入研究。本文仅对丁香油体外抗MRSA作用进行初步探讨，而关于其体内抗MRSA感染疗效及作用机制仍不清楚，机体作为一个复杂的系统，MRSA感染易受内外环境的影响。因此，项目组后续将进一步建立MRSA感染模型，深入研究丁香油体内单独使用，以及与β-内酰胺类抗生素联合使用的抗MRSA感染疗效，分析丁香油在体内抗MRSA感染的作用机制，探讨其急性和长期毒性，为后续丁香油在抗MRSA感染新药中的应用奠定基础。结论丁香油可以在体外抗MRSA感染，MIC为0.25mg/mL～0.51mg/mL。丁香油分别与3种抗生素一起使用时，分级抑菌指数集中分布在≤0.5和0.5～1，与头孢氨苄协同率为97.0％、与头孢吡肟的协同率为64.7％、阿莫西林协同率为58.8％；丁香油能明显增强这三种抗生素抗MRSA活性，减少抗生素的使用量，使其MIC50和MIC90降低为单独用药的1/4~1/2和1/2~1。生长曲线表明，丁香油明显使MRSA延滞期延长，降低其生长速度，使其生长量明显降低，抑制MRSA生长呈明显量效关系；当丁香油（1/4MIC）与头孢氨苄（1/4MIC）联合使用后，MRSA生长几乎被抑制。丁香油不仅自身具有较强的抗MRSA活性，共同使用时还可以加强β-内酰胺类抗生素抗MRSA作用,具备防治MRSA感染新药的开发与运用前景。参考文献LowyFD.Staphylococcusaureusinfections[J].NEnglJMed,1998,339:520-532.卢克鹏,宋洪涛.糖肽类抗生素在治疗MRSA感染中的PK/PD与给药方案的研究进展[J].中国医院药学杂志,2014,34(11):952-957.KlevensRM,MorrisonMA,NadleJ,etal.Invasivemethicillin-resistantStaphylococcusaureusinfectionsintheUnitedStates[J].JAMA,2007,298(15):1763-1771.deKrakerME,WolkewitzM,DaveyPG,etal.ClinicalimpactofantimicrobialresistanceinEuropeanhospitals:excessmortalityandlengthofhospitalstayrelatedtomethicillin-resistantStaphylococcusaureusbloodstreaminfections[J].AntimicrobAgentsChemother,2011,55(4):1598-1605.KluytmansJ,StruelensM.MeticillinresistantStaphylococcusaureusinthehospital[J].BMJ,2009,338(7693):532-537.王明强,张思森,刘小军,等.替考拉宁与万古霉素及利奈唑胺治疗MRSA感染患者的疗效评价[J].中华医院感染学杂志,2015,25(17):3923-3924.GiltnerCL,KelesidisT,HindlerJA,etal.Frequencyofsusceptibilitytestingforpatientswithpersistentmethicillin-resistantStaphylococcusaureusbacteremia[J].JClinMicrobiol,2014,52(1):357-361.StryjewskiME,CoreyRG.Methicillin-resistantStaphylococcusaureus:anevolvingpathogen[J].ClinInfectDis,2014,58(S1):S10-19.郝佳，刘哲，张瑜，等．苦参、绿茶及紫苏叶提取物联用对金黄色葡萄球菌的体外活性研究[J].天津中医药大学学报,2014,33(5):296-298.GardeteS,TomaszA.MechanismsofvancomycinresistanceinStaphylococcusaureus[J].\o"TheJournalofclinicalinvestigation."JClinInvest.2014,124(7):2836-2840.TanX,YangD,YangG,etal.Theinvestigationofinhib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