细胞工程学：第7章 细胞融合与体细胞杂交

第7章细胞融合与体细胞杂交酸酸甜甜才是生活！细胞杂交技术可以改变生活！同样，有没有可能培育出地下结土豆，地上结番茄的超级植物？1978年德国科学家梅歇尔斯将番茄与马铃薯进行体细胞杂交育成薯番茄“泡马豆”（po(tato)-(to)mato）。马铃薯与番茄两种原生质体的融合率竟高达40％～50％。植物细胞杂交视频观看：/special/show_3043714/ACRkYAQc9LIhIUwv.html这种植株已经杂交成功了，不过遗憾的是地上的马铃薯的地上部分，地下是番茄的地下部分既不结番茄也不结马铃薯本章主要内容：1细胞融合2体细胞杂交1、细胞融合定义及意义细胞融合（Cellfusion）是指使用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。如果亲本细胞是体细胞，也叫“体细胞杂交（somaticcellhybridization）”。

由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术在创造新细胞、培育新品种方面意义重大。§7-1细胞融合2、细胞融合的分类2.1从亲本来源：（1）同核体（Homokaryon）：基因型相同的细胞融合成的融合细胞称为。（2）异核体（Heterokaryon）：来自不同基因型的融合细胞。2.2从融合效果：（1）对称融合（Symmetricfusion）：两个完整的细胞间的融合。（2）不对称融合（Asymmetricfusion）：利用物理（如X、Y射线）或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再与另外一个完整细胞进行融合。后代变异较大，一般都是非整倍体。细胞核的融合是关键若是没发生细胞核的融合，仅发生了细胞质的融合，则可能成为嵌合细胞。含有多个核的异核细胞合并后形成的单核细胞称为合核细胞。细胞核的合并发生在有丝分裂过程中。但是这种有丝分裂只有当两个核的DNA合成基本同步时才能发生：两个核同时进行有丝分裂，形成一个纺锤体，全部染色体都排列在一个赤道板上，结果伴随着细胞分裂就形成了单核的子细胞，其细胞核中含有双亲细胞的染色体。3、细胞融合的主要步骤（1）优良亲本选择（单细胞或原生质体制备）（2）两原生质体或细胞互相靠近，粘附（3）质膜融合形成细胞桥（关键一步）（4）胞质渗透（5）细胞核融合（6）融合细胞筛选细胞桥的形成4细胞融合方法1.生物法病毒诱导细胞融合：是研究最早的细胞融合诱导方法。主要是由于病毒会与宿主细胞膜直接融合，同时进入两个细胞就会打破两个细胞膜的隔阂，引发细胞质的交流，进而达到细胞融合的目的。原因可能是病毒的磷脂外衣与动物细胞膜相似，病毒外壳上的某些糖蛋白有促进细胞融合的功能。仙台病毒、疱疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒等。仙台病毒（HAJ）是两层磷脂组成的外膜包裹着RNA与蛋白质的复合体。因HAJ病毒毒力弱，易被灭活而常采用。缺点：要提前大量培养病毒，并且灭活后才能作为融合剂使用，操作繁琐，而且一旦灭活不充分的话，病毒还可能感染操作者与亲本细胞。因此，目前已经很少使用病毒诱导法进行细胞融合。病毒介导融合原理与过程（1）足够量的病毒颗粒附着在细胞膜上起搭桥作用，使细胞聚集在一起。（2）通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相融合。粘结部位质膜被破坏，不同细胞间形成通道，细胞质流通并融合（病毒也随之进入细胞质）。（3）有丝分裂，细胞核融合，形成杂种细胞。（4）融合细胞筛选。2化学法采用化学诱导剂促使细胞融合，包括：NaNO3、高pH的高浓度Ca2+离子、聚乙二醇（PEG）、溶菌酶、明胶、抗体、植物凝血素伴刀豆球蛋白A等。机理在于：细胞膜电荷平衡被打破。（1）NaNO3诱导融合1909年，凯斯特（Kuster）发现机械分离的发生了质壁分离的洋葱表皮细胞原生质体在NaNO3溶液中可以恢复并伴随着细胞融合。1972年，卡尔森（Carlson）利用NaNO3诱导融合了粉兰烟草和郎氏烟草原生质体，培育出世界第一株体细胞杂种。原理:NaNO3的钠离子可以中和原生质体表面负电荷，引起原生质体聚集，促进细胞融合。NaNO3对原生质体无损害，但融合效率低，一般小于4%。（2）高pH的高浓度Ca2+离子诱导融合1973年，凯勒（Keller）和梅尔切斯（Melchers）发现采用强碱性（例如pH10.5）的高浓度钙离子溶液（50mmol/LCaCl2•2H2O）在37℃下处理两个品系的烟草叶肉原生质体，很容易促使融合，融合率可以达到10%。原理：钙离子中和原生质体膜或细胞膜表明表面电荷，使彼此紧密接触，决定质膜的稳定性和可塑性；高pH能改变质膜的表面电荷，利于细胞融合。（3）PEG诱导聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)是一种多聚化合物，分子式为H(OHCH2-CH2)nOH)。常用的PEG平均分子量在200－20,000之间，分子量1,000以下者为液体，1,000以上者为固体。1、PEG分子具有轻微的负极性，可以与具有正极性基团的水分子、蛋白质、碳水化合物形成氢键，在相邻的原生质体间起到分子桥的作用，使原生质体接触。

当PEG分子被洗脱时，膜电荷发生紊乱而重新分配。此时，一种原生质体上带正电的基团可能与另外一个原生质体中带负电的基团相连，导致原生质体融合。可能机理：2、PEG可以改变细胞膜的理化性质，增加膜脂的流动性，使细胞膜发生疏松和重排，导致细胞融合。（4）高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导在高Ca2+和pH溶液的作用下，将与质膜结合的PEG分子洗脱，将进一步加剧电荷平衡失调，从而提高融合的几率。因此，PEG结合高pH的高浓度Ca2+离子诱导融合方法成为一种较常用的细胞融合方法。优点：融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。缺点：是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。PEG法诱导融合3物理法电融合诱导法（Electrofusion）：利用电场来诱导细胞彼此连接成串，再施加瞬间强脉冲促使质膜发生可逆性电击穿，促进细胞融合的技术。原理：在直流电脉冲的刺激下，细胞膜或原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种细胞或原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。优点：融合率高、重复性与可控制性强。缺点：可能会造成不可恢复的细胞损伤。

电融合步骤：（1）聚集：两种亲本细胞在直流电脉冲的诱导下，极化产生偶极子，彼此靠近，定向排列成串球状。（2）细胞膜融合：在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄，触发膜的穿孔（质膜瞬间破裂）。（3）异核体：膜之间形成通道，细胞质等得以交换、融合。（4）融合细胞：细胞核融合。融合率达到16-27%，原生质体存活率97%§7.2体细胞杂交1Somaticcellhybridization：指将不同来源的体细胞融合，并使之分化再生、形成新品种的技术。2体细胞杂交育种的意义1克服远缘杂交不亲和性，创造新物种。2与基因工程改造相比的优点：植物的抗逆性多为多基因控制，因此易于实现多基因控制性状。3实现细胞质遗传组合：农作物一些性状如细胞质雄性不育、抗除草剂性，都是由胞质遗传物质控制引起的遗传现象（又称非染色体遗传）。3体细胞杂交技术路线技术：细胞融合+植物组织培养关键环节：细胞筛选与杂种植物鉴定4杂种细胞筛选方法（1）抗药性筛选法：–

利用细胞对药物敏感性差异筛选融合细胞。例如亲本细胞A只对amp敏感，亲本细胞B只对Kan敏感，则在含有amp和Kan的培养基上，融合细胞会生存，而双亲本死亡。（2）营养互补筛选法：–

利用两亲本细胞营养互补可以筛选融合细胞。例如，亲本A为色氨酸Trp缺陷型，B为苏氨酸Thr缺陷型，则在不含色氨酸和苏氨酸培养基上培养时，双亲本死亡，而杂种细胞存活。异硫氰酸荧光素（FITC，绿色荧光）和异硫氰酸罗丹明（RITC，红色荧光）（4）荧光标记法两个亲本原生质体在融合前用能发不同颜色荧光的荧光染料分别进行染色，则融合细胞显示两种荧光标记。但仪器价格昂贵，不常用。（3）物理特性筛选法：–利用亲本原生质体形态、大小、颜色差异如采用倒置显微镜用微管将融合细胞吸取出来。（1）形态学特征鉴定（2）细胞学鉴定（3）同工酶鉴定（4）分子标记鉴定：RFLP鉴定、RAPD、SSR标记鉴定5杂种植物鉴定形态学和细胞学鉴定

（1）形态学鉴定：根据茎、叶、花等组织的形态、颜色来鉴别杂种。两亲本的亲源关系较远时，杂种植物的形态倾向于亲本之一，但存在差异。（2）细胞学鉴定：原生质体融合的亲本材料一般为二倍体，杂种细胞的染色体应该为双二倍体。如果亲本的亲源关系较远，染色体差异会较大；同时，杂种细胞中一亲本的染色体可能会受到另外一亲本的排斥，可能会产生大量非整倍体。因此可以从杂种植物染色体的数目鉴定是否是杂种植物。18条染色体36条染色体

（3）同工酶（isoenzyme）鉴定同工酶：是催化的化学反应相同而理化性质、免疫学活性都不同的一组酶。由于蛋白质分子量和表面所带电荷不同，其等电点也不同，故在电场中移动的速率不同而使蛋白质分离。由于同工酶理化性质、免疫学活性都不同，因此可以用电泳法分离。原理：根据亲本和杂种植物的同工酶谱的差异来鉴别杂种植物。杂种植物的同工酶谱是双亲本酶谱的总和，表现为条带增多、酶带颜色加深、宽度加大，有时还出现两亲本都不具有的新谱带或者丢失部分亲本酶带。常用来作为分析对象的有乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、过氧化物酶、酯酶、氨肽酶、核酮糖二磷酸羧化酶等。

DNA分子标记鉴定：是在分子水平对亲本和杂种植物遗传性状差异进行鉴定，能正确揭示出生物个体间核苷酸序列的差异。一些基因指纹技术（如RFLP

、RAPD、SSR等）已经成功应用于杂种的鉴定。RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphisma,限制性内切酶片段长度多态性)RAPD（RandomAmplificationofPolymorphicDNA，随机扩增的DNA多态性），可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。其以基因组DNA为模板,以单个人工合成的随机多态核苷酸序列(通常为10个碱基对)为引物,进行PCR(PolymeraseChainReaction)扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后,在紫外透视仪上检测多态性。扩增产