-葡萄糖苷酶ec3221研究进展

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e3。2.1.21岁。它的英文名称是“界脂鱼”，属于水解酶类。1987年，leebig和wohel首次在苦杏仁中发现，然后在自然界中发现。它可以来源于植物、微生物,也可来源于动物。它的特性是可水解结合于末端、非还原性的β-D-糖苷键,同时释放β-D-葡萄糖和相应的配基;此外还能微弱地水解对硝基苯-β-D-半乳糖和β-D-木糖苷。根霉能在许多种纤维素物质上生长,正是由于它能产生包括β-葡萄糖苷酶在内的多种纤维素酶所致。目前,国内外对于β-葡萄糖苷酶的研究,已经从单纯分离纯化分析其酶学性质向采用各种手段,如培养基优化或基因工程手段选育工业化生产用β-葡萄糖苷酶高产菌株及其实际应用的方向发展。谢宇,尚晓娴等研究了来源于曲霉No5.1的β-葡萄糖苷酶的纯化和酶学性质。粗酶液经沉淀、柱层析得到纯β-葡萄糖苷酶,SDS凝胶电泳显示一条带,测得分子量为67.5kD。何可可,薛栋升等采用从海底淤泥中筛选得到的曲霉Aspergillussp.菌株,进行固体发酵生产胞外纤维二糖酶,酶的比活力由10.98U·mg-1提高到131.21U·mg-1。纯化得到的纤维二糖酶具有明显的海洋酶耐盐和耐热特性,有更广的应用范围。瞿丽莉,朱均均等研究了固体发酵法制备β-葡萄糖苷酶及其在纤维素水解上的应用。王冰冰,夏黎明等研究了黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在里氏木霉中的表达,发酵试验表明,基因表达产物可以在cbh1信号肽的引导下顺利地向细胞外分泌。发酵48h,重组菌株的纤维二糖酶活力可以高达5.3IU·mL-1,是原始菌株的106倍。李旭晖,朱明军等建立1种测定粗纤维素酶中β-葡萄糖苷酶酶活的方法。该方法简单、快速、灵敏度高。1半乳糖苷酶家族根据氨基酸序列分类,人们将β-葡萄糖苷酶划分在糖苷水解酶家族1和3中。家族1中的β-葡萄糖苷酶来源于细菌、植物;家族3中的酶来自真菌、细菌和植物。家族1中的酶除有葡萄糖苷酶活性外,还有很强的半乳糖苷酶活性。根据高级结构的相似性,糖苷酶家族可以被分成若干部族(Clan),糖苷水解酶家族1属于“clanGH-A”(superfamily4/7)。其特点是催化结构域具有(β/α)桶状结构,2个羧基氨基酸参与催化反应,作为质子供体和亲核基团,分别位于第4位和第7位的β折叠上。Moracci等通过比较11种糖苷族1的氨基酸序列,发现了-N-E-P-和-Y-l-E-N-2个保守序列,并用定点突变的方法证明了保守序列中的2个Glu分别是酸、碱基团和亲核基团。也有试验通过自杀底物共价修饰和定点突变试验证明了这种结论。23-葡萄糖糖苷酶的理化性质和加速反应机制2.1相对分子量和ph值β-葡萄糖苷酶有胞内酶和胞外酶之分,有些生物体内只含有胞内β-葡萄糖苷酶,也有的只含胞外β-葡萄糖苷酶,但有少部分微生物体内同时含有胞内和胞外β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶的相对分子量一般在40~250ku之间。不同来源的β-葡萄糖苷酶的相对分子量由于其结构和组成不同而差异很大。大部分β-葡萄糖苷酶的最适pH值都在酸性范围,并且变化不大,但最适pH值可以超过7.0,而且酸碱耐受性强。β-葡萄糖苷酶的最适温度在30~110℃之间,一般来说,来自细菌的β-葡萄糖苷酶其稳定性和最适温度要高于普通微生物来源的β-葡萄糖苷酶。对于工业应用来说,酶的热稳定性越高越有利,对来自嗜热性和非嗜热性β-葡萄糖苷酶的分析认为,两者在相互演化过程中的酶修饰作用并不改变酶的活性中心,也不改变其专一性,只是将酶蛋白结构作部分调整以适应高温环境。2.2中心也是糖苷酶的底物结构多数β-葡萄糖苷酶中起催化作用的残基是两个谷氨酸残基,其中,靠近N端的谷氨酸起酸/碱作用,另一谷氨酸起亲核试剂的作用。但Grabnitz等研究发现,来自Clostridiumthermocellum的β-葡萄糖苷酶的活性部分在N端的130个氨基酸区域,该区的个性特征是氨基酸序列中心基团His-Asn-Glu-Pro,存在于该区域的具有催化作用的残基是相隔35~55个氨基酸的His和Glu,其中质子化态的完全保持残基His121作为质子供体与G1u166协同稳定氧碳正离子。而高度保持的C端附近的残基也许参与了酶与糖苷基底物的键合,其中在该区的一些微小差异与不同β-葡萄糖苷酶的底物特异性有关。Bauer等对分别来自嗜热菌Pyrococcusfuriosus和非嗜热菌Agrobacterium的β-葡萄糖苷酶进行研究发现,两种来源的酶催化反应时按同一种机制进行,即在催化糖苷键的裂解反应时都遵循双取代反应机制。其反应方程如下:第1步是酶与底物键合成米氏复合物ES(反应速率K1和K-1)。第2步是酶一底物中间体(E-S)的形成(反应速率K2);酶的亲核基团按酸催化机制进攻异头碳,形成共价的糖基酶中间体(E-S)。第3步是中间体的水解:由水按碱催化机制对异头碳进攻,形成β-葡萄糖基产物并使酶回复其初始的质子化态。3-葡萄糖酶活性测定目前对于葡萄糖苷酶活性的测定方法很多,概括起来主要有分光光度法、荧光法、电化法等。3.1.1分光光度法3.1.2第1组光的吸收法3.1.4对硝基苯基-d-葡萄糖苷为酶底物的检测另外还有电化法,该方法是以扁桃苷为底物,根据所产生的氢化物,用与自发(内)电解池相联结的一对银-铂电极的发放测定其β-葡萄糖苷酶活性。以水杨苷为酶反应底物的方法检测的是经β-葡萄糖苷酶水解底物产生的极微量的葡萄糖,反应易受干扰,且检测灵敏度不高。荧光法最初用于酶含量低的高等动物组织中的β-葡萄糖苷酶的检测,灵敏度高且快速,但是由于实验过程操作复杂,且重现性不好,现在应用不多。以对硝基苯基β-D-葡萄糖苷为酶底物的比色法最为普遍,且在实验中该方法操作简单,快速,灵敏度高,重现性好。以京尼平苷为底物检测β-葡萄糖苷酶活性的方法与pNPG法相比,灵敏度低,但是精密度和准确度较好,结果稳定。微生物中β-葡萄糖苷酶活性检测普遍采用以对硝基苯β-D-吡喃葡萄糖苷为酶底物的比色法[19~24]。Mcmahon等采用此方法检测10株不同的霉菌,其中7株菌株的葡萄糖苷酶活性在575~2650μmol/L,且实验数据重现性好。另外,国内也有采用以水杨酸为底物,然后通过DNS法测定还原糖含量来计算酶活性的方法。该实验检测的是反应生成的极微量葡萄糖,反应易受干扰,且检测灵敏度不高,误差大,不适用于植物中低含量葡萄糖苷酶的检测。王华夫等用以对硝基苯基β-D-葡萄糖苷为酶底物的比色法,测定了不同品种的茶鲜叶β-葡萄糖苷酶活性。江昌俊等以对硝基苯基β-D-葡萄糖苷为酶底物,研究了茶叶中β-D-葡萄糖苷酶活性的测定条件。董尚胜等研究了茉莉花β-D-葡萄糖苷酶活性测定条件。宋晓青也选用以对硝基苯基β-D-葡萄糖苷为酶底物的比色法,探讨了蜡梅花β-葡萄糖苷酶的活性检测方法。4-葡萄糖糖苷的酶固定和应用4.1-葡萄糖苷酶的固定化G.Matthijs比较了用相同材料两种不同固定化方法对β-葡萄糖苷酶固定化效果的影响:方法1是β-葡萄糖苷酶经葡聚糖二醛交联后包埋于氨基丙基硅胶中,方法2则将β-葡萄糖苷酶直接包埋在经葡聚糖二醛改性的硅胶中,结果显示,方法1获得的固定化酶的热稳定性得到很大提高,而方法2获得的固定化酶热稳定性较差,究其原因,研究者认为,上述2种固定化方法中与载体结合的酶分子数不同。YannickG等将β-葡萄糖苷酶固定在DuoliteA-568树脂中以改善葡萄酒风味,结果发现固定化酶在流化床反应器中6h15min后可将葡萄酒中的风味前体物100%降解,而在固定床反应器中6h40min后可将葡萄酒中的风味前体物90%降解,该固定化体系有望在饮料风味的改善中得以应用。M.Sardar等用pH两性载体EudragitS-100对β-葡萄糖苷酶进行的固定化研究发现,与游离酶相比,固定化酶km和最适pH没有显著变化,但酶活回收率为87%。J.M.Gue6bcmez等将β-葡萄糖苷酶固定于碳纳米管中,取得了令人满意的结果,12h内每克纳米管通过静电作用能够吸附分子量为135ku的β-葡萄糖苷酶630mg,固定化酶的活力达400U/g(在试验条件下,每分钟水解1μmol对-硝基苯β-D-葡萄糖苷为一个活力单位)。我国学者张正竹等以蚕丝素蛋白为载体,研究了黑曲霉发酵产生的β-葡萄糖苷酶的固定化及固定化后酶的性质;结果表明,采用共价法把β-葡萄糖苷酶固定在丝素蛋白膜上,固定后的β-葡萄糖苷酶膜性质稳定,活力回收率为56.3%,固定化酶的最适pH值没有明显改变,但最适反应温度由固定化前的50℃升高到固定化后70℃,酶的酸碱稳定性和热稳定性均有明显提高。4.2不同成分对胡柚糖苷酶的控制效果Gueguen等用β-葡萄糖苷酶处理桔子、苹果、葡萄等多种水果汁,再用GC-MS的方法分析酶处理前后主要风味成分的变化,结果表明,芒果、桔子、草莓和苹果汁的风味成分分别提高了1250%,79l%,705%和141%。孙爱东等对不同来源的β-葡萄糖苷酶酶解橙汁中键合态主要芳香物质的效果发现,杏仁酶对橙汁的键合态组分的酶解效果好于微生物酶,但对橙皮的作用效果相反;因此,来源广泛、价格低廉的微生物酶是适合于工业化生产的风味酶制剂。李平等用感官鉴评的方法对β-葡萄糖苷酶处理后的苹果汁和柠檬汁的风味进行研究,结果表明经β-葡萄糖苷酶处理过的样品,除具有样品本身固有的特征香气外,香气组成上更加圆润、柔和、饱满,增强了感官效应。潘利华等将β-葡萄糖苷酶用于胡柚脱苦试验,结果发现,胡柚中的主要苦味物质柠檬苦素和柚皮苷含量有所下降,而且不影响胡柚中Vc含量。Gueguen等用外源β-葡萄糖苷酶直接处理酒精体积分数为0.15的葡萄酒后,用GC-MS分析香气成分的变化,结果发现酶处理样和对照相比,香叶醇、苯甲醇、橙花醇、2-苯乙醇和芳香醇分别提高了1200%,1575%,600%,500%和155%。而陈守人等用感官鉴评的方法,研究了β-葡萄糖苷酶对干红葡萄酒风味的影响,结果也表明经酶处理的果酒,香气更加浓郁协调,风味显著提高。茶叶香气是茶叶品质的重要特征之一。香气形成机理研究结果表明,内源糖苷酶对茶叶花香形成起着很重要的作用。茶叶中β-葡萄糖苷酶的分离纯化、特性研究以及外源酶进行茶香气改善试验亦已展开。茶香气改善试验结果表明,醇系香气如芳香醇及其氧化物,香叶醇、橙花醇和苯乙醇等的形成与β-葡萄糖苷酶活性有着密切关系。随着酶活性的升高,香叶醇、橙花醇、芳香醇氧化物等以糖甙形式存在于茶叶中的萜烯类化合物均有所增加;脂肪族,萜烯类或芳香族香气也明显比游离态(酶解前)要高。大豆异黄酮共l2种,由大豆苷元、染料木素、大豆黄素3种异黄酮苷元以及它们和乙酰葡萄糖、葡萄糖、丙二酰葡萄糖以β-糖苷键形成的9种异黄酮糖苷组成。研究表明,大豆苷元、染料木素、大豆黄素3种异黄酮苷元是大豆异黄酮发挥药理功能的活性形式,不具活性的大豆异黄酮糖苷需经β-葡萄糖苷酶水解为活性苷元才能被吸收进体内发挥作用。大豆自身含有的内源β-葡萄糖苷酶水解活性不强,水解效率只有22%~29%。添加足量的高活性酶(如苦杏仁和酵母中提取β-葡萄糖苷酶)可使水解达到100%。据报道,豆奶中添加β-葡萄糖苷酶或接种产β-葡萄糖苷酶的微生物,都能够将豆奶及豆奶粉中生物有效性较低的异黄酮糖苷化合物高效转化为高活性的异黄酮苷元[38~39]。纤维素酶转化纤维成葡萄糖的过程细节和作用机理还不清楚或未有定论。一般认为纤维素类物质经酶促作用转化成葡萄糖至少需要3种酶:内切l,4-葡聚糖酶;外切纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。内切葡聚糖酶和外切纤维二糖水解酶把纤维素降解成纤维二糖,它再被β-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。纤维素酶作用主要是通过这3种酶协同进行,最后将纤维素转化成葡萄糖,在这个过程中β-葡萄糖苷酶起了关键作用。5目前，研究是紧迫的，有必要解决问题，解决途径和趋势5.1生物处理设备的应用因为β-葡萄糖苷酶是将纤维素转化为葡萄糖的关键酶,是纤维素酶系中将纤维素转化为葡萄糖的瓶颈,如果能彻底阐明其作用机理,从而大幅度提高其酶活力,就可以将植物纤维———地球上最丰富的可再生资源,应用于发酵食品工业原料,对人类将是一个重大的贡献。5.2要建立酶活力的测定针对不同来源的β-葡萄糖苷酶分别建立更加简便精准的活力测定方法体系,同时规范对酶活力的定义,使不同测定方法之间逐步建立可换算的酶活力单位,从而使不同来源的β-葡萄糖苷酶活力具有可比性,有利于对β-葡萄糖苷酶进行更深入的研究。5.3工业专利开发企业这需要大力开展中试生产研究,将现有的许多实验室研究成果推向工业生产;探索新的固定化材料和方法,提高固定化酶活性收率,延长半衰期,降低成本;探索固定化酶在有机合成生产领域的新工艺。5.4酶解产物的检测域更广,需要在百分多已经有关于β-葡萄糖苷酶和其它酶类协同作用处理汁、果酒原料等方面的研究,均取得了良好的效果,β-葡萄糖苷酶和其它酶类协同作用应用研究前景,尤其是在食品研究领域将更加广阔。以水杨苷作底物,将水杨苷裂解为水杨醇和葡萄糖,然后将酶解产物中的水杨醇用4-氨基安替比林显色,再用分光光度法比色测定;或对所产生的葡萄糖用DNS试剂显色后进行比色测定;也可用熊果苷(葡萄苷一对苯二酚)作为底物,对产生的葡萄糖用碘量法加以测定。用4-甲基伞形酮β-D-葡萄糖苷作为底物,经β-葡萄糖苷酶作用,专一地分解为4-