酱腌菜咸胚中二氧化硫的测定 气相色谱法 征求意见稿编制说明

地方标准《酱腌菜咸胚中二氧化硫的测定气相色谱法》编制说明一、任务来源及背景说明本标准为地方标准制定项目，2023年由湖南省市场监督管理局立项，湖南省食品标准化技术委员会归口，下达文件：湘市监标函[2023]25号。酱腌菜是腌菜和酱菜类的总称，是以新鲜蔬菜为主要原料，经腌制或酱制加工而制成的蔬菜制品。酱腌菜是历史悠久的传统菜肴，因口感鲜脆、风味独特受到老百姓的青睐，成为餐桌上不可或缺的佐餐菜。酱腌菜种类繁多，包括酱渍菜、盐渍菜、糖渍菜、酱油渍菜、虾油渍菜、盐水渍菜等多种类型。我国酱腌菜的腌制已有上千年的历史，最早可追溯到周朝时期。据《周礼天官》记载：“大羹不致五味，铡羹加盐菜”。所谓羹就是用肉或咸菜做成的汤，这是我国关于酱腌菜最早的文字记载。国内酱腌菜腌制历史悠久，行业市场也在持续扩大。作为酱腌菜腌制历史最为悠久的国家之一，早在2012年，我国酱腌菜市场规模已经超过日本、美国等国家。目前，我国已成为全球最大的酱腌菜市场，国内酱腌菜产能在满足国内市场需求的同时，还出口至欧美日等海外市场。据统计，2016-2021年，我国酱腌菜市场规模从74.6亿美元增长至94.5亿美元。我省酱腌菜生产主要集聚在我市岳阳市，该产业蓬勃发展，作为主要经济支撑行业之一，现有大型企业湖南插旗菜业有限公司、湖南国泰食品有限公司、湖南洞庭明珠食品有限公司等。但2022年央视“3·15”晚会腌制菜生产引发众多网友关注。其中，康师傅等企业老坛酸菜供应商湖南插旗菜业有限公司曝光，该企业标准化腌制池腌出来的酸菜，是用来加工出口产品的，而内销的老坛酸菜包里的酸菜，则是从外面收购来的“土坑酸菜”。事件过后，政府和企业启动对相关产品的下架回收，其带来的经济社会影响是巨大的。基于此，我中心启动关于酱腌菜系列标准的研究工作，以期保障产业可持续发展。受酱腌菜生产工艺的制约和销售品质的需求，亚硫酸盐在酱腌菜制品中被广泛使用。亚硫酸盐类是一类漂白剂，具有防腐、护色、抗氧化等效果，能够改善产品的外观品质，延长产品的保质期，因此成为酱腌菜企业广泛使用的食品添加剂。目前，二氧化硫现有检测方法主要为GB/T5009.34-2022《食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定》，标准中包含三种方法：第一法酸碱滴定法，二氧化硫定量限为0.01g/kg；第二法分光光度法，二氧化硫定量限为0.006g/kg；第三法离子色谱法，二氧化硫定量限为0.006g/kg。二、制定的目的和意义酱腌菜是我国人民喜食的一种佐餐小菜，具有悠久的历史，最早可以追溯到二千多年前。它最初只是作为一种储存蔬菜的方法，后来经过长期品食和改良，发展成为现在的许多带有浓厚民族特色和地方风味的酱腌菜制品。它既清香味美、富有营养、又经济实惠；不仅可登大雅之堂，又是居家、旅游必备的美味食品，因而备受人们的喜爱。二氧化硫在通常状态下是一种无色的有刺激性气味的气体，有毒，易溶于水，并且溶解后和水发生化学反应生成亚硫酸。二氧化硫是国内外允许使用的一种食品添加剂，在食品工业中发挥着护色、防腐、漂白和抗氧化的作用。如在酱腌菜加工过程中，利用二氧化硫和亚硫酸盐类的氧化性，能有效地抑制酱腌菜加工过程中的非酶褐变；利用其还原性和漂白性，也可作为防腐剂，抑制霉菌和细菌的生长。所以在酱腌的生产加工过程中，经常加入部分二氧化硫、亚硫酸盐等，使酱腌菜褪色和免于褐变，改善外观品质，延长保质期。但近年一些不法商贩在利益的驱使下，在酱腌菜生产中大量地添加二氧化硫及其盐类是导致二氧化硫超标的主要来源，2011年，全国食品安全整顿办公室印发《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第五批）》，其中将焦亚硫酸钠列入易滥用的食品添加剂名单，故对酱腌菜中二氧化硫含量的检测十分重要。二氧化硫及其衍生物对人体的各种系统、器官、组织都会产生不利的影响。二氧化硫进入呼吸道后，因其易溶于水，所以大部分被阻塞在上呼吸道，在湿润的黏膜上生成具有腐蚀性的亚硫酸、硫酸和硫酸盐，使刺激作用增强，损害支气管和肺，进而可以诱发各种呼吸道炎症。目前，食品中二氧化硫的检测方法有比色法、滴定法和色谱法等。新出台的国标《食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定》（GB5009.34-2022）提出酸碱滴定法、分光光度法、离子色谱法，其中第一法滴定法作为测定食品中二氧化硫的主要方法，但需采用充氮蒸馏，耗时长，大批量检测存在一定局限性，作为理化常规检测方法，检出限方面与色谱也有一定的差距。第二法分光光度法，直接提取法适用于白糖及白糖制品、淀粉及淀粉制品和生湿面制品中二氧化硫的测定，充氮蒸馏提取法适用于葡萄酒及赤砂糖中二氧化硫的测定，酱腌菜不适用；第三法离子色谱法测定各类食品中的二氧化硫残留量，但前处理需蒸馏提取样品，检测效率也不高。其他标准，如《T/ZACA022-2020食品中二氧化硫的测定蒸馏-电感耦合等离子体发射光谱法》采用蒸馏后离子色谱检测，产品类别也不适用酱腌菜，现阶段没有任何标准采用顶空-气相色谱法对酱腌菜中二氧化硫进行检测，我中心积累历年检测和科研经验，发现该方法前处理简单，检出限低，准确度和灵敏度高，干扰小，重复性好，可以大批量检测酱腌菜中的二氧化硫，大大缩短检测时限，能够更好为我市酱腌菜企业提供服务保障。因此本标准旨在建立顶空-气相色谱法测定酱腌菜中二氧化硫，包括样品制备和检测的方法，该方法确立将填补顶空-气相色谱法测定酱腌菜中二氧化硫检测标准的空白，同时为进一步对国标食品中二氧化硫测定方法的制修订提供技术支持。三、制定标准工作简介1、主要工作过程 本标准的编制工作从2023年3月开始，由岳阳市检验检测中心食品农产品检验部具体承担。本标准制定严格按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》要求进行。从接到标准的编制任务开始，参加编写的人员就开始收集酱腌菜中二氧化硫的相关资料。包括收集二氧化硫的文献和各类标准、酱腌菜中二氧化硫检测方法相关文献，组织编制组成员多次讨论研究，初步确定酱腌菜二氧化硫的试验方案。其次，编制组成员通过探究性试验，优化前处理方法和色谱条件，确定了试验方案。并对试验方案进行反复确证研究，包括精密度试验、回收率试验、实际样品检测，确定了最终试验方案。项目组经过多次讨论修改，初步形成了标准征求意见稿。再次，项目组就标准草案征求了湖南省产商品质量检验研究院、长沙市食品药品检验所、广电计量检测（湖南）有限公司等检验机构或公司相关技术专家的意见。最后，项目组对各方专家顶空-气相色谱法检测酱腌菜中二氧化硫的测定方法地方标准的意见和建议进行了充分讨论研究，形成了《酱腌菜咸胚中二氧化硫的测定气相色谱法》征求意见稿。2、标准主要起草人及分工见表1表1主要起草人及分工序号起草人所在单位主要工作1朱明扬岳阳市检验检测中心项目负责人2朱礼任务负责人3朱冬香岳阳市食品药品审评认证与不良反应监测中心项目总体联络4袁列江湖南省产商品质量检验研究院技术指导5吴海智技术指导6余莲芳岳阳市检验检测中心主要研究人员7李立标准文本编写8刘乐琪企业联络与沟通9刘宇实验操作10李格实验操作11孙逸清实验操作12李维实验操作13上官佳湖南省产商品质量检验研究院主要研究人员14徐文泱主要研究人员15薛敏敏主要研究人员16陈瑶主要研究人员17邓航主要研究人员18冉丹长沙市食品药品检验所主要研究人员四、标准编制原则本标准的编制遵循GB/T1.1-2020《标准化工作导则—第1部分：标准化文件的结构和起草规则》和GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》的要求编写制订，标准编制遵循“科学性、实用性、统一性、规范性”的原则，重点突出在方法准确性、可操作性，并注重标准的统一性和规范性。五、标准的重要内容说明1范围本文件规定了酱腌菜咸胚中二氧化硫的测定方法。本文件适用于气相色谱法测定酱腌菜咸胚中二氧化硫。2原理试样酸化后在加热条件下亚硫酸盐等系列物质释放二氧化硫，顶空进样后，二氧化硫与其他组分分离，用电子捕获检测器检测，以外标法定量。3实验方法的确定与验证3.1检测方法的确定酱腌菜中二氧化硫的检测采用毛细管色谱柱GS-GasPro(30m×0.32mm，0μm)进行分离，顶空进样，气相色谱仪ECD检测器进行测定。以无水亚硫酸钠作为标准品，样品经甘露醇-乙二胺四乙酸二钠溶液提取，加入磷酸酸化，在顶空瓶中90℃加热条件下亚硫酸盐等系列物质释放出二氧化硫，以释放的二氧化硫作为目标产物，采用外标法进行定量。3.2标准溶液的配制3.2.1无水亚硫酸钠标准储备溶液（1.0mg/mL）：准确称取0.1g（精确至0.0001g）标准物质置于100mL容量瓶中，用甘露醇-乙二胺四乙酸二钠溶液溶解并定容。3.2.2无水亚硫酸钠标准中间溶液(100μg/mL)：准确吸取标准储备溶液10mL至100mL容量瓶中，用甘露醇-乙二胺四乙酸二钠溶液定容。3.2.3无水亚硫酸钠标准工作溶液：分别准确吸取标准中间溶液0.50mL、1.0mL、2.5mL、5.0mL、10mL、25mL置于50mL容量瓶中，用甘露醇-乙二胺四乙酸二钠溶液定容，分别配制成1.0、2.0、5.0、10、20、50μg/mL的标准系列工作溶液。3.3试样前处理的要求称取2g(精确至0.01g)匀浆试样，置于20mL顶空瓶中，加入甘露醇-乙二胺四乙酸二钠溶液10mL，向顶空瓶中置入盛有1mL磷酸的玻璃小瓶，钳好顶空瓶盖，颠倒顶空瓶摇匀，超声提取10min。3.4前处理方法及仪器测定条件的选择和优化3.4.1方法原理试样酸化后在加热条件下亚硫酸盐等系列物质释放二氧化硫，顶空进样后，二氧化硫与其他组分分离，用电子捕获检测器检测，以外标法定量。本方法分别考察了标准溶液配制液及样品提取液、反应酸、反应酸加入量、色谱柱类型、顶空条件（平衡温度和平衡时间）的影响，优化试验条件。3.4.2标准溶液配制液及样品提取液的选择本方法分别考察了采用水、氢氧化钠、氯化钠溶液及0.5%的甘露醇与0.1%的乙二胺四乙酸二钠混合溶液作为标准溶液配制液及样品提取液的影响。结果显示，分别采用水、氢氧化钠及氯化钠溶液作为标准溶液配制液时，标准溶液稳定性较差，只能临用前配制，一次性使用，而采用0.5%的甘露醇与0.1%的乙二胺四乙酸二钠混合溶液作为标准溶液配制液及样品提取液时可以使标准溶液及样品提取液中的二氧化硫稳定。3.4.3反应酸的选择本方法分别考察了采用盐酸、硫酸及磷酸作为反应酸的影响。盐酸易挥发，本方法选用是顶空进样方法，其传输管线都是不锈钢材料，不耐酸易腐蚀，且也会与二氧化硫发生反应，产生一氯甲烷干扰峰；采用硫酸作为反应酸时，易引入本底值，不宜采用。因此，本文件采用磷酸作为反应酸，磷酸可避免不利因素，且不影响检测结果。由于样品酸化后二氧化硫会立即溢出，即使迅速压好顶空瓶盖也难以避免，故本方法先将磷酸置于玻璃小瓶内，再将玻璃小瓶放入盛有样品的顶空瓶中，用玻璃小瓶将酸与样品相隔绝，压盖密封后再倾倒顶空瓶让其相互反应，可以获得更好的重现性。3.4.4反应酸加入量的选择往50μg/mL的标准溶液中分别加入0.10、0.20、0.50、1.00、2.00和3.00mL磷酸，考察二氧化硫峰面积的响应值。结果显示，加入1.00mL磷酸时二氧化硫峰面积响应值最高，故选择加入1.00mL磷酸作为反应酸。3.4.5色谱柱的选择本方法分别考察了不同气相色谱毛细管柱的影响，分别选用了DB-1701(30m×0.32mm×0.50μm)、DB-WAX(30m×0.32mm×0.25μm)及GS-GasPro(30m×0.32mm，0μm)进行试验。结果显示，采用DB-1701和DB-WAX毛细管色谱柱时，二氧化硫标准样品色谱峰均出现拖尾现象影响分离，而采用GS-GasPro毛细管色谱柱时可使水与二氧化硫完全分离，杜绝了水峰拖尾影响二氧化硫的测定。GS-GasPro毛细管色谱柱采用独特的键合硅胶PLOT技术，是含硫气体分析的最佳选择，该色谱柱具有极高的保留时间稳定性，且不受水分的影响，故选择GS-GasPro(30m×0.32mm，0μm)作为本方法的色谱柱。3.4.6顶空条件的优化本方法顶空条件的优化主要是考察顶空平衡温度和平衡时间的影响，本试验选取了平衡温度为70℃、80℃和90℃时，在相同气相色谱条件下，分别考察平衡10min、20min和30min50μg/mL的标准溶液的峰面积响应值。结果表明，选择平衡温度为80℃样品平衡时间为30min和平衡温度为90℃样品平衡时间为10min进行测定时，可以获得较大的峰面积。但考虑到节省检测时间提高检测效率，故本方法选择平衡温度为90℃样品平衡时间为10min。3.5方法验证3.5.1方法线性范围准确吸取10mL1.0、2.0、5.0、10、20、50μg/mL的标准系列工作溶液，置于20mL顶空瓶中，向顶空瓶中置入盛有1mL磷酸的玻璃小瓶，钳好顶空瓶盖，颠倒顶空瓶摇匀，超声提取10min，置于全自动顶空装置中90℃平衡10min后经气相色谱仪分析测定，以标准溶液浓度（μg）为横坐标，二氧化硫的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线见图1，线性相关系数和回归方程见表2。结果表明，在10～500μg的浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数（R2）为0.9998。表2二氧化硫峰面积及线性方程编号浓度（μg）峰面积110590222011324350227344100478365200925986500225580线性方程y=448.2898x+1913.1564相关系数（R2）0.9998图1二氧化硫标准曲线3.5.2方法检出限（LOD）和方法定量限（LOQ）按照3倍信噪比计算检出限（LOD），10倍信噪比计算定量限（LOQ），经计算，当称样量为2g时，本方法的检出限（LOD）为0.0003g/kg，定量限（LOQ）为0.001g/kg。3.5.3方法回收率和精密度分别称取酱腌菜（剁辣椒）匀浆样品2g(精确至0.01g)，加入适量的无水亚硫酸钠标准溶液，轻微涡旋混匀，进行三水平六平行加标试验。加标水平浓度分别为0.0100g/kg、0.0250g/kg、0.0500g/kg。加标样品放置30min，以使标样充分被吸附，分别加入甘露醇-乙二胺四乙酸二钠溶液10mL，向顶空瓶中置入盛有1mL磷酸的玻璃小瓶，立即封闭顶空瓶口，超声提取10min，置于全自动顶空装置中90℃平衡10min后经气相色谱分析测定，测定结果见表3。结果显示，三水平加标回收率范围为93.0%~104%，相对标准偏差RSD（n=6）为1.41%~2.62%，表明本方法具有良好的准确度和精密度。表3回收率和精密度试验结果添加水平浓度（g/kg）样品本底值（g/kg）样品实测值（g/kg）回收率（%）平均回收率（%）相对标准偏差RSD(%)0.01000.01060.020296.098.02.260.02101040.019993.00.020498.00.02091030.020094.00.02500.034495.298.22.620.03661040.03601020.034896.80.034595.60.034696.00.05000.057593.895.91.410.0