紫花杜鹃及矮地茶的提取工艺及药效研究

紫花杜鹃及矮地茶的提取工艺及药效研究

0紫茶颗粒的高效提取及纯化复合紫茶是由杜鹃和低地茶以1:1的比例混合而成的粉末。滤液是用浸泡过的盐浓缩的，然后添加糖。这是治疗咳嗽和哮喘的经典方剂。紫花杜鹃中的黄酮类化合物和低地茶中的岩白菜素是有效的成分。然而，该药物的活性成分含量低，使用剂量高，治疗周期长，给患者带来不便。根据该研究中紫茶不适用于高效提取和提取紫茶材料，实现二次开发。黄酮类化合物和岩白菜素均为醇溶性化合物,其易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂,微溶于水.因此,为了提高黄酮类化合物及岩白菜素的提取率,可采用乙醇-水体系作为提取溶剂对紫花杜鹃及矮地茶分别进行提取研究.在单因素实验的基础上,通过响应面分析及正交试验研究紫花杜鹃中黄酮类化合物及矮地茶中岩白菜素的最佳醇提取工艺,利用大孔吸附树脂、氨水除杂及结晶法分别对黄酮类化合物及岩白菜素提取物进行纯化,从而提高紫茶中活性成分的提取率及纯度,为开发高效、速效、服用量少和携带方便的中药新制剂提供参考及依据.1材料和方法1.1仪器和试剂实验材料:紫花杜鹃(购于广州致信药业,为紫花杜鹃带叶嫩茎)、矮地茶(购于安徽亳州中药材市场,为矮地茶的干燥叶与带叶嫩枝)、无水乙醇(AR,成都市联合化工试剂研究所)、其他试剂(均为分析纯).仪器设备:紫外可见分光光度计(WFZUV-2102PCS,尤尼柯(上海)仪器有限公司)、恒流泵(BT100-1J,保定兰格恒流泵有限公司)、自动收集器(BSZ-100,上海沪西分析仪器厂有限公司)、真空干燥箱(DZF-6050,上海一恒科技有限公司)、真空冷冻干燥机(ALPHA2-4,博励行仪器有限公司).1.2实验方法1.2.1提取和提取黄酮类化合物1.2.1.紫花植物总黄酮类化合物的提取分别称取10g紫花杜鹃干燥嫩叶粗粉置于5个250mL锥形瓶中,以乙醇为提取溶剂,选取乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%,在液料比为6mL/g、8mL/g、10mL/g、12mL/g、15mL/g,提取温度为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃,转速为100r/min的条件下恒温振荡,分别提取1次、2次、3次,每次提取时间分别为1h、1.5h、2h、2.5h、3h,提取完毕过滤,合并滤液,采用CH3COOK-Al(Cl)3比色法测定总黄酮含量.在单因素实验的基础上,选择提取次数为2次,对乙醇浓度、液料比和提取时间对紫花杜鹃中黄酮类化合物的提取效果进行三因素三水平的响应面分析,以获得紫花杜鹃中黄酮类化合物醇提的优化工艺.1.2.1.上柱流速及上柱流速选用HPD-600大孔吸附树脂,对紫花杜鹃黄酮类化合物提取物进行纯化,吸附条件为pH值5.8(原液pH),上柱浓度1.0mg/mL,上柱流速4.5mL/min;解吸条件为解吸液采用80%乙醇,解吸流速2mL/min,从第10min开始收集,共收集80mL洗脱液,浓缩蒸干得紫花杜鹃黄酮浸膏.1.2.2岩白菜素提取和提取1.2.2.岩白菜素提取时间的确定分别称取10g矮地茶干燥嫩叶粗粉置于5个250mL锥形瓶中,以乙醇-水为提取溶剂,选取乙醇浓度为20%、30%、40%、50%、60%,在液料比为6mL/g、10mL/g、12mL/g、15mL/g、20mL/g,提取温度为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃,转速为100r/min的条件下恒温振荡,分别提取1次、2次、3次,每次提取时间分别为1h、1.5h、2h、2.5h、3h,提取完毕过滤,合并滤液,采用紫外吸收法测定滤液中岩白菜素的含量.在单因素实验的基础上,选择提取次数为2次,对提取溶剂乙醇浓度、液料比、提取温度和提取时间对矮地茶中岩白菜素提取效果的影响进行L9(34)正交试验,以获得提取矮地茶中岩白菜素的优化工艺.1.2.2.精制岩白菜素的提取和测定岩白菜素英合物的提取将提取所得岩白菜素浸膏加入到乙醇中,搅拌均匀,加氨水,调节pH为9~10,有棕色沉淀析出,过滤,反复3次,合并滤液,加水稀释并加热,趁热滤去不溶物.滤液放置过夜,即有白色结晶析出,收集结晶,母液继续放置析出更多结晶,合并结晶,即得精制岩白菜素.取少量用40%乙醇溶解,用紫外-可见分光光度计测定其吸光度值,计算精制岩白菜素得率及纯度.1.2.3关于药物效率的研究1.2.3.不同浓度紫花植物叶片、矮地茶岩白菜素的合成空白对照组小鼠灌服等容量的生理盐水,阳性对照药选用可待因,分别给药灌服紫茶颗粒溶液、紫茶药材水煎煮提取纯化物溶液、紫花杜鹃黄酮类化合物提取纯化物与矮地茶岩白菜素提取纯化物的一定比例混合物(对应紫花杜鹃与矮地茶比例为1∶1)溶液,每天一次,连续灌服7天,于末次给药30min后将小鼠放入500mL烧杯中,10s内逐渐喷入25%的氨水液3mL,立即取出小鼠,观察和记录小鼠咳嗽的潜伏期和2min内的咳嗽次数,各组小鼠交叉进行,测定抑制率.抑制率=空白组咳嗽次数均值-给药组咳嗽次数均值空白组咳嗽次数均值×100%1.2.3.不同药物对呼吸道酚红排泌量的影响空白对照组灌服等容量的生理盐水,阳性对照药选用氯化铵,分别给药灌服紫茶颗粒溶液、紫茶药材水煎煮提取纯化物溶液、紫花杜鹃黄酮类化合物提取纯化物与矮地茶岩白菜素提取纯化物的一定比例混合物(对应紫花杜鹃与矮地茶比例为1∶1)溶液,通过测定小鼠呼吸道酚红排泌量判断药物对呼吸道分泌液量的影响,测定祛痰指数,从而间接评价药物的祛痰作用和强度.祛痰指数=给药组气管段酚红排泌量空白组气管段酚红排泌量2结果与讨论2.1紫花植物化合物最佳提取工艺的确定以黄酮类化合物的纯度作为考察指标,采用SAS8e进行统计分析,得到紫花杜鹃中黄酮类化合物纯度Y与各因素变量间的函数关系为:Y=15.37552+0.169808*X1+0.191607*X2+0.241069*X3-0.781385*X12+0.23125*X1*X2-0.21375*X1*X3-0.090187*X22+0.73875*X2*X3-0.63466*X32其中,X1-乙醇浓度(%),X2-液料比,X3-提取时间(h).将建立的回归模型中的任一因素固定为零水平,得到另外两个因素的交互影响作用,二次回归方程的响应面及其等高线如图1~图3所示.由图1可见,乙醇浓度对黄酮类化合物纯度的影响更为明显,当乙醇浓度为82%、液料比为12mL/g附近时黄酮类化合物纯度达到最高.由图2可见,随着乙醇浓度和提取时间的加大,黄酮类化合物的纯度先增大而后减小,当乙醇浓度为80.54%,每次提取时间为2.2h附近时其纯度达到最高.由图3可见,当液料比为12mL/g,每次提取时间为2.2h附近时,黄酮类化合物的纯度达到最高,且提取时间对纯度的影响大于液料比的影响.由此确定黄酮类化合物最佳提取工艺为:乙醇浓度80%、液料比10mL/g、提取两次,每次提取时间2.2h.在此条件下,重复实验3次,得到紫花杜鹃中黄酮类化合物的提取率平均为96.85%,纯度平均为15.42%,与预测值基本一致,证实了该模型的有效性.2.2紫花植物催化剂的纯化对影响大孔吸附树脂纯化效果的因素进行单因素实验,获得合理的纯化条件,在此基础上对紫花杜鹃黄酮类提取物进行纯化,吸附率可达88.9%,解吸率为93.5%,最终获得紫花杜鹃黄酮类化合物纯度为78.64%,达到了较好的纯化效果.2.3最佳提取工艺的确定在单因素实验的基础上,确定提取次数为2次,对提取溶剂乙醇浓度、液料比、提取温度和提取时间对矮地茶中岩白菜素提取效果的影响进行L9(34)正交试验.实验因素水平如表1所示,正交试验结果列于表2及表3.在以上提取条件下,以岩白菜素的提取率及纯度作为考察指标进行分析,确定最佳提取工艺条件.从表2可见,在影响乙醇提取的4个因素中,对岩白菜素提取率影响大小的因素依次为:提取时间>乙醇浓度>提取温度>液料比,提取率最高的条件为A3B3C1D2;对岩白菜素纯度影响大小的因素依次为:乙醇浓度>提取温度>提取时间>液料比,岩白菜素纯度最高的提取条件为A2B1C2D2.从岩白菜素提取率、岩白菜素纯度、溶剂用量等方面综合考虑,确定各因素较优的水平组合为A2B1C2D2,即提取溶剂为40%乙醇,液料比为10mL/g,提取温度为60℃,提取次数为2次,提取时间为每次2h.按照优选出的工艺条件进行提取,结果岩白菜素的提取率为92.85%,其纯度为20.69%.2.4岩白菜素的纯化采用氨水除杂及结晶法,提取所得岩白菜素浸膏经精制纯化后其纯度达到了72.65%,岩白菜素转移率为85.46%,保留了绝大部分活性成分,说明利用乙醇加氨水去除鞣质,利用岩白菜素的热水溶性去除脂溶性杂质,能有效提高岩白菜素的纯度.2.5醇-水法纯化碳质文献中的活性成分由表3和表4实验结果可见,以紫茶颗粒原提取工艺对紫茶药材采用醇提及醇-水提取两种药材中的活性成分,并通过大孔吸附树脂纯化黄酮类化合物,与加氨水除杂法及结晶法纯化矮地茶中岩白菜素的混合物,其止咳祛痰作用均高于原紫茶颗粒,其止咳抑制率为60.