第五章 分子生物学研究方法(上)

第五章分子生物学研究方法

DNA、RNA及蛋白质操作技术DNA分子的切割与连接核酸分子杂交凝胶电泳细胞转化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定点突变PCR扩增等核心技术分子生物学研究从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因就是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。5.1重组DNA技术回顾——三大成就：1、20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；（1928FrederickGriffith&1944OswaldAveryTransformationofStreptococcuspneumoniae）2、50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题。但是：如果没有分离和富集单一DNA分子的技术，科学家就无法对这类物质进行直接的生化分析。仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组远不能满足基因研究的需要。DNA片段在体外不具备自我复制能力，要想得到足够量和足够纯度的DNA，必须将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。这就是基因克隆或分子克隆。1970年，Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒DNA。从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。5.2DNA基本操作技术

5.2.1核酸的凝胶电泳自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法。DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。

1、基本原理一种分子在电场中，它会以一定的速度移向适当的电极。把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度越快，反之则较慢。由于在电泳中用无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等，故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。图3-2：以禽巴氏杆菌C48-3株基因组DNA为模板PCR扩增的

cp39基因M：DNAmarkerofDL1500；1：PCR产物；2：阴性对照。M：标准DNA-DL2000；1：PCRproducts;2：Negativecontrol.图2-2：体内外培养禽巴氏杆菌荚膜蛋白的SDS结构M：低分子量标准蛋白；1-4：体外培养的X-73，C48-3，P-1059和C51-3株荚膜蛋白；5-8：体内培养的巴氏杆菌X-73，C48-3，P-1059和C51-3株荚膜蛋白。

脉冲电场凝胶电泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE)这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。该方法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来，应叫交替电场凝胶电泳。5.2.2细菌转化与目标DNA分子的增殖细菌转化（transformation）一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征改变的过程。提供转化DNA的菌株叫做供体菌，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌。感受态：

细菌能从周围环境中吸收DNA的生理状态称为感受态(competence).

感受态的出现是由于细菌表面出现许多DNA结合位点，这些位点只能与双链DNA结合，而不与单链DNA结合。这说明完整的双链结构对于转化活性来说是必要的；DNA的进入和整合均为单链状态。细菌转化的一种可能机制（1）细菌感受态的形成（2）转化子的吸收（3）整合符合物前体的形成（4）单链DNA转化子的整合（5）转化子的形成

1.

CaCl2诱导大肠杆菌转化法

Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌.其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态(Competence)。(a)在0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时Ca2+

使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离，形成感受态。(b)Ca2+

与DNA分子结合，形成抗DNase的羟基－磷酸钙复合物，并粘附在细菌表面。(c)当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多缝隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。CaCl2诱导法的可能机制大肠杆菌感受态细胞的质粒转化（1）取100μl感受态细胞，加入相当于50ng载体的重组DNA连接液，混匀；（2）冰浴放置半小时；（3）在42℃保温2分钟（热脉冲）；（4）快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-2分钟；（5）加入1ml新鲜培养基，于37℃培养1小时；（6）涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。转化率：5×106~2×107个转化子/ug质粒将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。2.电击法转化大肠杆菌:

优化参数—电场强度、电脉冲长度、

DNA的浓度。转化率：109-1010转化子/μgDNA.电穿孔转化仪感受态细胞转化率：转化体总数=菌落数×（转化反应总体积/涂板菌液体积）插入频率=白色菌落数/（白色菌落数+蓝色菌落数）转化频率=转化体总数/加入质粒DNA总量（ug）5.2.3聚合酶链式反应

PolymeraseChainReaction(PCR)1.PCR的定义在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。2.PCR技术的优点（1）特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等；（2）能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍。3.PCR技术原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。模板DNA变性：加热至94℃左右，双链DNA解离成单链；模板DNA与引物的退火(复性)：55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的双链；重复循环变性--退火--延伸三过程，使DNA扩增量呈指数上升。PCR过程（1）denaturatation（2）Primerannealing（3）PrimerextensionPCRproductPCR反应曲线4.PCR的标准反应体系10×PCR缓冲液10μl

4种dNTP混合物各200μmol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2μg

TaqDNA聚合酶2.5U

Mg2+

1.5mM

无菌D.W

100ul5.PCR反应五要素primerTaqDNApolymerasedNTP:dATP、dGTP、dCTP、dTTP

TemplateDNA

Mg2+（1）引物A.引物是PCR特异性反应的关键;B.PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度.引物设计的原则①引物长度：15-30个碱基，常为20个碱基左右;②引物扩增跨度：以500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段;③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜,ATGC最好随机分布.④避免引物内部出现二级结构避免两引物间互补，特别是3`端⑤引物3`端的碱基要求严格配对特别是最末及倒数第二个碱基⑥引物中可以加上合适的酶切位点要作酶切时加⑦引物的特异性引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性（2）酶浓度A.

TaqDNA聚合酶注：无3`→5`方向的校正活性B.一个典型的PCR反应约需酶量2.5U。浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。（3）dNTP的质量与浓度dNTP质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。A.dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解；B.在PCR反应中，dNTP应为20～200μM，注意4种dNTP的浓度要相等。（4）模板DNA模板DNA的含量与纯度，是PCR成败的关键环节之一。（5）Mg2+浓度A.Mg2+对扩增特异性和产量有显著影响:

Mg2+浓度过高，反应特异性降低；浓度过低会降低TaqDNA聚合酶活性，使反应产物减少。B.在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200μM时，Mg2+浓度为1.5-2mM为宜。6.PCR热循环条件的选择PCR反应条件:温度时间循环次数(1)温度与时间的设置●设置变性-退火-延伸三个温度点：

1）93-95℃变性

2）40-60℃退火

3）70-75℃延伸●对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（2）循环次数●决定PCR扩增程度

●主要取决于模板DNA的浓度

●选在25～40次之间（3）延伸温度与时间A.延伸温度：一般在70～75℃之间，常用温度为72℃；B.延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定,1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min。注意：

A.延伸时间过长会导致非特异性扩增；B.对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。（4）引物的复性温度

当引物长度为15-20个碱基时，在高离子强度中反应（如1MNaCl）。

Tm=4（G+C）+

2（A+T）复性温度=Tm值-（5～10℃）复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合7.PCR技术的应用（1）基因组中特异片段克隆（2）RT-PCR（3）基因的体外诱变（4）基因组的比较研究5.2.4实时定量PCR（RealtimequantitativePCR）建立实时定量PCR技术的必要性常规PCR：可扩增特定核苷酸片断；用凝胶电泳可检测PCR扩增产物（定性）；同位素标记及光密度扫描技术可检测PCR产物量（定量）。研究证明：PCR产物总量变异系数常常达到10%-30%。但是我们所感兴趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量。如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下实时定量PCR技术应运而生。荧光定量PCR的原理PCR扩增呈指数增长，在反应体系和条件完全一致的情况下，样本DNA含量与扩增产物的对数成正比，由于反应体系中的荧光染料或荧光探针与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增产物量成正比，因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。实时定量PCR和常规PCR的区别（1）常规PCR是通过琼脂糖电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析（定量不准确）；（2）荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA或cDNA的起始浓度进行定量的方法（准确定量）。Non-specificDNAbindingdyes:-SYBR®GreenI-SYBR®Gold-EthidiumBromide非特异性嵌入荧光染料评价优点：与特异性的荧光探针相比价格便宜只需要设计PCR引物缺点：由于它和模板的结合是非特异性的，它可以和所有的双链DNA包括引物和非特异性扩增产物结合，不能真实反映目的基因的扩增情况。特异性荧光探针将特异性寡核苷酸被荧光素标记，制备荧光标记的DNA探针。通过探针与PCR产物特异性的结合，可均相、实时定量检测在整个PCR过程中产量。TaqMan探针：一段5’端标记报告荧光基团(R)，3’端标记猝灭荧光基团(Q)的寡核苷酸，其序列与模板DNA中的一段完全互补。当探针单独存在时，由于荧光共振能量转移的发生,R荧光受到Q的猝灭。在PCR过程中，由于TaqDNA酶的5’→3’外切酶活性的作用，使探针的5’端的R被切除，加大了与Q的距离而使荧光恢复。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此，Taqman探针检测的是积累荧光。TaqMan探针评价优点：荧光信号强与其它探针相比设计简单可用于多通道检测

缺点：比DNA结合染料价格高（ThresholdCycle，Ct）阈值在PCR扩增过程中扩增产物荧光信号超过基线值或进入指数增长期时的循环数。荧光扩增曲线可分3个阶段荧光背景信号阶段：扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。荧光信号指数扩增阶段：PCR产量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。平台期：扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR终产物量与起始模板量间无线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。5.2.5基因组DNA文库的构建基因组文库：含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子(克隆)的总和基因组文库特点：由于基因组文库来自于某一物种的基因组，而该物种所有组织中的基因组均相同，所以基因组文库具有种属特异性，无组织特异性。cDNA文库—cDNA文库来自于某一物种某种组织的mRNA，所以cDNA文库既有种属特异性，也有组织特异性。基因组文库的大小理论值:基因组文库的克隆数目＝基因组DNA总长/DNA插入片段的平均长度。例如：细菌基因组DNA总长度=3×106kb

酶切后的DNA片段平均长度=15kb

基因组文库的克隆数=3×106kb/15kb=2×

105个克隆经验值：N—基因组文库克隆总数P—在基因组文库中目的基因DNA片段的出现概率f—插入片段大小与基因组DNA大小比值N=Ln(1–P)Ln(1–f)例如：基因组文库中含目的基因DNA片段的出现概率达到99%，即P=0.99。N=Ln(1–0.99)Ln(1–15/3×106)=9×106经验值比理论值越大4.5倍5.3RNA基本操作技术真核生物基因组DNA非常庞大，而且含有大量重复序列，无论用电泳分离还是用杂交方法都难以直接分离到靶基因片段。

cDNA则来自反转录的mRNA，不含冗余的序列，通过特异性探针筛选cDNA文库，可以较快地分离到相关基因。5.3.1总RNA的提取

总RNA包括：mRNA，rRNA，tRNA以及sRNA。动物细胞：约含10-5ug/细胞

totalRNA：rRNA—80%~85%tRNA以及sRNA—15%~20%mRNA—1%~5%总RNA的抽提方法常用的方法：异硫氰酸胍-苯酚抽提法迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质和细胞核中的RNA释放出来并使核糖体蛋白与RNA分子分离，还能保证RNA的完整。RNA浓度和纯度测定：

OD260=1，RNA浓度为40ug/ml；

OD260/OD280=1.8~2.0，RNA纯度较好；

OD260/OD280〉1.8，蛋白质或酚污染。RNA的琼脂糖电泳检测：变性条件下进行琼脂糖电泳，因为RNA易形成二级结构而且易降解。常用变性剂是有甲醛、尿素等。5.3.2mRNA的纯化根据真核细胞mRNA的结构特征来纯化mRNA。5.3.3cDNA的合成

cDNA合成包括第一链和第二链的合成。以mRNA为模板，用oligodT和反转录酶合成第一条cDNA。用RNaseH

切割mRNA-cDNA杂合链中的mRNA成小片段后，以第一条cDNA为模板，用DNA聚合酶合成出第二条cDNA。5.3.4cDNA文库的构建由于cDNA的长度一般在0.5~8kb，常用的质粒载体和噬菌体载体都能满足要求。cDNA文库载体选择要根据该文库的用途来确定。例如：Uni-zapXR载体是一种λ噬菌体载体，具有噬菌体的高效性和质粒载体系统可利用蓝白色筛选的便利，可容纳10kbDNA插入片段，重组载体通过体内剪切反应（invivoexcision）将cDNA插入片段转移到质粒系统中，克隆和序列分析。5.3.5基因文库的筛选通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有目的基因片段的特定克隆的过程。核酸杂交法用放射性同位素标记的特异DNA探针适用于高密度的菌落杂交筛选。2.PCR筛选法

PCR筛选法与核酸杂交法具有同样的通用性，而且操作简便，但前提是已知足够的序列信息并获得基因特异性引物。3.免疫筛选法

免疫筛选法是基于抗原-抗体特异性结合的原理，所以该法适用于表达型文库的筛选。5.4SNP的理论与应用单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）是指基因组DNA序列中单核苷酸（A、T、C和G）的变异所引起的DNA序列多态性。基因组DNA同一位点上的碱基类叫做一个等位位点。SNP是基因组中最简单、最常见的多态性形式，具有很高的遗传稳定性。5.4.1SNP的概述一个SNP表示在基因组DNA某个位点上一个核苷酸的变化，这种变化可能是转换（C↔T，在其互补链上则为G↔A），也可能是颠换（C↔A，G↔T，C↔G，A↔

T），具有转换型变异的SNP约占SNP总量的2/3左右。

SNP广泛存在于人类基因组中，其发生频率约为1%或更高。据估计，人类DNA中每300~1000bp就有一个SNP，因此，一个人类个体大约携带300万~1000万个SNPs。位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单倍型（haplotype），相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体遗传个后代。例如：玉米储藏蛋白的8个基因型共包含了3个单倍型(H1，H2和H3)，它们分别由多个相邻的SNP所构成。H2H15.4.2SNP的检测技术限制性酶切片段长度多态性（RFLP）、PCR-单链构象多态性（PCR-SSCP)、毛细管电泳和变性高效液相色谱（DHPLC）等。由于这些技术都必须通过凝胶电泳进行分析，通量受到限制。且这些方法仅能判断SNP的有无而不能知道确切的碱基类型，只要进行DNA测序分析才能确认所发现的SNP。基因分型（genotyping）：利用数据库中已有的SNP进行特定人群的序列和发生频率的研究，包括基因芯片技术、Taqman技术、分子信标技术（molecularbeacon）和焦磷酸测序法等。1.基因芯片技术（Genechip）

固相支持介质上进行杂交和原位荧光检测的一种高通量SNP分析方法。通过优化芯片杂交程度，使探针只与完全互补的序列能杂交，而不能与含有错配的碱基的序列杂交。待测基因样品经PCR扩增及荧光化学标记后与固定的探针进行杂交。

由于目标基因和探针杂交的程度与荧光强度及种类相关，因此通过荧光扫描，可根据荧光强弱或荧光的种类检测出被检序列的碱基类别。基因芯片技术固体平面(玻片、尼龙薄膜)DNA样品微点的排列DNA/DNAorDNA/RNA碱基配对原则荧光标记的探针cDNA芯片制备、工作过程cDNA文库vectorPCR96-wellplate杂交、洗涤、扫描…………….…………….……