第三章 基因克隆的载体

基因工程华中师范大学生命科学学院陈明清《基因工程原理》第一章导论第二章基因操作的工具酶第三章基因克隆的载体第四章基因克隆的策略第五章克隆基因的表达第六章基因工程的基本技术第三章基因克隆的载体引言（introduction）第一节质粒载体（plasimidvectors）第二节噬菌体载体（phagevectors）第三节柯斯质粒载体（cosmidvectors）第四节人工染色体载体（B/Y/HAC）引言基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。作为基因克隆的载体必须具备以下特性：能在寄主细胞中进行独立的复制和表达；具有1-2个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等；具备多克隆位点（MCS），而且可携带外源DNA片段的长度范围较宽。自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作和DNA的制备。CharacteristicsofvectorsforgenecloningMCSMarkerForeigngene第三章基因克隆的载体引言（introduction）第一节质粒载体（plasimidvectors）第二节噬菌体载体（phagevectors）第三节柯斯质粒载体（cosmidvectors）第四节人工染色体载体（B/Y/HAC）第一节质粒载体（plasimidvectors）1、质粒的生物学特性2、质粒载体相关知识介绍1.质粒的生物学特性（1）质粒是一种广泛从在于细菌细胞中染色体以外的能自主的复制的裸露的环状双链DNA分子，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。1.质粒的生物学特性（2）质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb。（3）质粒的生存在寄主细胞中“友好”地“借居”，离开了寄主它本身无法复制，它可以赋予寄主一些非染色体控制的遗传性状，以利于寄主的生存。比如，对抗菌素的抗性，对重金属的抗性等。1.质粒的生物学特性（4）质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为两种复制型：“严紧型”质粒（stigentplasmid）,拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxedplasmid）,拷贝数为10-60。不过，即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间也可能有很大的变化。（5）质粒的不亲和性两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。已鉴别出25个以上大肠杆菌质粒的不亲和群，它们之间是相容的。1.质粒的生物学特性（6）质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种，双螺旋共价闭合环（超螺旋）开环双螺旋（一个裂口）线状双螺旋（两个裂口）质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。SCOCL1.质粒的生物学特性

质粒的可转移性

革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：

接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等

非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员某些非接合型质粒在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定天然质粒的局限性天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。第一节质粒载体（plasimidvectors）1、质粒载体的生物学特性2、质粒载体相关知识介绍质粒载体：作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分。多克隆位点：克隆载体中的一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。选择标记基因：在基因工程中的一类用于选择转化细胞（菌）的抗性基因，通常是一些抗生素抗性基因，比如对氨苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素以及潮霉素等具有抗性的基因。这样，通过在培养基中加入特定的抗生素就可以选自得到转化的细胞（菌）。pBR3224363连接加反应液TetorAmpTet+AmpCK+2.质粒载体相关知识介绍（1）PBR322pSP2124质粒的Ampr基因pBR322：（1）元件来源F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建载体。①复制起点

oripMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点②

Ampr基因③Tetr基因pSC101的Tetr基因。（2）长度4363bp（3）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。（4）克隆位点其中9个会导致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3个会导致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24个克隆位点。pBR322的优点①双抗菌素抗性选择标记

插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞

在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞

在Amp或Tet其中之一中死亡。外源基因

BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因

PstITet中存活但在Amp中死亡氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy④安全失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。③

高拷贝数②

分子小，克隆能力大载体越小越好。>10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。保留了转移蛋白（mob）的作用位点。pBR322的缺点能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移！①删除mob识别位点（如质粒pBR327、pAT153等）。pAT153：从pBR322上切去HaeII片断，既除去了mob识别位点，又增加质粒的拷贝数。PBR322的改进pBR325：在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片断（带有氯霉素抗性基因cmlr）。

cmlr上也带一个EcoRI位点。使EcoRI也成为插入失活型位点。②

改造EcoRI位点（2）pUCUniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC192.质粒载体相关知识介绍①

复制起点pBR322的

ori但其上失去了克隆位点。②

Ampr基因（1）元件来源③lacZ的启动子大肠杆菌④lacZ’基因大肠杆菌lacZ的

-肽链序列，

是LacZ的氨基端片断。pBR322的Ampr基因（2）长度约2.7kb（3）克隆位点10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的5’端。

-互补

(alpha-complementation)

大肠杆菌-半乳糖苷酶可以和其底物X-Gal相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的-片段和-片段分开时就失去了这种显色的功能。通常将编码该酶-片段的LacZ基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中，而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能编码产生该酶的片段。这样一来，含有功能性完整的LacZ

基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的-片段就能和寄主编码的片段发生互补并具有了对底物X-gal的作用功能（发生显色反应），这种现象被成为是alpha-complementation.所以含有这类载体的菌落就很容易在含有底物X-Gal和诱导物IPTG的平板上分辨出来。因为这类菌落中释放出的蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色，非常容易辨别。However,CloningofDNAinsertsintooneoftheuniquesitesinthepolylinkercaninactivatesthelacZgeneandleadstocolourlesscoloniesonX-Gal/IPTGplates,allowingforreadydetectionofcoloniescarryingclonedDNA.（3）pGEM-3Z多拷贝装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’2.质粒载体相关知识介绍（3）pGEM-3Z

装有两个噬菌体的强启动子用于外源基因的高效表达T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等表达型质粒载体装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件，主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻译信号控制之下。注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。复制起始点ORI、选择标记、多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因I操纵基因O启动基因P核糖体结合位点序列（SD）

转录终止信号区。1）普通载体元件①表达载体的结构（4）pET

pETvectorsaredesignedtoallowtheexpressionofclonedgenestoproteins.pET-5hasaregionencodinganelevenaminoacidstretchofproteinbeforeEcoRIandBamHIrestrictionsites.Cloningintothesesitesresultsinexpressionoftheclonedinsertasafusionprotein.UseofNdeIenzymeincuttingvectorandinsertallowsexistedcodontobereplacedbytheinitiationcodonoftheinsert,resultinginexpressionoftheinsertwithnofusion.

2.质粒载体相关知识介绍（4）pBluescriptSK

pBluescriptSKissimilartothepGEMvectorsexceptthatitalsocarriesanoriginofreplicationforafilamentousphage,f1.f1usesasinglestrandedDNAmoleculeasagenomeandpBluescriptKScanbeusedtogeneratessDNA.Ifahostcellcarryingsuchaplasmid,superinfectionwithphagef1leadstoproductionofphagecontainingplasmidDNA.2.质粒载体相关知识介绍第三章基因克隆的载体引言（introduction）第一节质粒载体（plasimidvectors）第二节噬菌体载体（phagevectors）第三节柯斯质粒载体（cosmidvectors）第四节人工染色体载体（B/Y/HAC）第二节噬菌体载体（phagevectors）1、噬菌体的生物学特性2、噬菌体载体3、M13噬菌体的生物学特性4、M13噬菌体载体1.噬菌体的生物学特性

ThePhage

consistofalinearchromosomeenclosedinaproteincoat(capsid,衣壳).Whenthephageinfectingthehostcells,itinjectsitsDNAintothehostbacterium.1.噬菌体的生物学特性噬菌体的生长周期可分为溶菌周期和溶源周期两种类型。前者指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。在溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。只有溶菌生长周期的噬菌体被称为烈性噬菌体。只有溶源周期的噬菌体被称为温和噬菌体。整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细菌。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA被称为原噬菌体。1.噬菌体的生物学特性

Lyticcycle(溶菌周期)ofgrowth:TheinjectedDNAinhostbacteriumreplicatedmanytimes,phagestructuralproteinsareexpressedandthenewphagechromosomesarepackagedintophageheads.Newphagesarethenreleasedbylysis(溶胞)ofthehostcell.1.噬菌体的生物学特性

Lysogeniccycle

(溶源周期)：Undercertaincircumstances,however,thelambdaDNAinsertsitselfintotheE.colichromosomeandisastablepartofthechromosome.TheLambdaDNAisreplicatedalongWiththeE.colichromosome.Ifthehostcellbecomesdamaged,suchasUVtreatment,theprophageDNAexcisesitselfandundergoeslyticgrowth.l噬菌体生物学特性：溶原状态l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态1.噬菌体的生物学特性

DNA为线状双链DNA分子，长度为48502bp，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形DNA分子。上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为cos位点（cohesiveendsite）.DNA至少包括61个基因，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分可以被外源基因取代而不会影响到噬菌体的正常功能。l噬菌体生物学特性：生物结构5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l-DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体生物学特性：感染周期体内包装100个左右的拷贝包装范围为原DNA的75-105%即36-51kbDA第二节噬菌体载体（phagevectors）1、噬菌体的生物学特性2、噬菌体载体3、M13噬菌体的生物学特性4、M13噬菌体载体l-DNA载体的构建：缩短长度野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：插入型载体取代型载体l-DNA载体的构建：缩短长度插入型载体体外包装插入位点体外包装插入片段载体长度37kb插入片段大小：0-14kb（51–37）l-DNA载体的构建：缩短长度取代型载体体外包装体外包装插入片段最小装载长度10kb（51–26）载体长度26kb插入片段最大装载长度25kb（36–26）l-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶切位点l-DNA载体的构建：加装选择标记与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记颜色反应类标记l-DNA载体的构建：加装选择标记imm434imm434基因编码一种阻止l-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的l-载体进入受体细胞后，建立