电泳技术参考课件

电泳技术带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis，简称EP)。1937年瑞典科学家Tiselius建立了“移界电泳法(movingboundaryEP)”，成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖金。

50年代，许多科学家着手改进电泳仪，寻找合适的电泳支持介质，先后找到滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物。60年代，Davis等科学家利用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密切相关的医学、农、林、牧、鱼、制药、某些工业分析中必不可少的手段。

第一节基本原理

一、泳动度

带电颗粒在电场中泳动的速度称迁移率或泳动度(mobility)，可用下式表示：

U=v/E=(d/l)/(V/l)=dl/Vt式中，U(也可以用m表示)为泳动度(cm2/V穝)；v为颗粒泳动速度(cm/s)；E为电场强度(V/cm)；l为支持物的有效长度(cm)；V为实际电压(V)；t为通电时间(s或min)。电泳后通过侧量V,t,d,l，即可计算出被分离物质的泳动度。

泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量，颗粒大小和形状有关。一般说，净电荷数量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，泳动度愈大。被分离的球形分子在电场中所受的力(F)为：

F=EQ

式中，E为电场强度，即每厘米支持物的电位降，Q为被分离物所带净电荷。根据Stoke定律，一球形分子在液体中泳动所受的阻力(摩擦力)F′为：

F′=6πrηv

式中，η为介质粘度，r为分子半径，v为分子移动速度。当平衡时：F=F′，即EQ=6πrηv

∴v=EQ/6πrη∵U=v/E∴U=Q/6πrη

由上式可见泳动度与球形分子半径、介质粘度、颗粒所带电荷有关。

二、影响泳动度的因素

1.电场强度

电场强度是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势梯度)。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。根据电场强度的不同，电泳可分为：(1)常压(100-500V)电泳。其电场强度为2-10V/cm。分离时间较长，从数小时到数十小时，适合于分离蛋白质等大分子物质。(2)高压(2000-10000V)电泳。其电场强度为50-200V/cm，电泳时间很短，有时只需几分钟。多用于分离氨基酸、多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。2.溶液pH

为使电泳时pH值恒定，必须采用缓冲液作为电极液，溶液的pH值决定带电颗粒的解离程度，亦即决定其所带电荷的多少。对蛋白质而言，溶液pH值离等电点(pI)越远，则颗粒所带的净电荷越多，泳动速度也越快；反之，则越慢。因此分离某种蛋白质混合液时，应选择一个合适的pH使欲分离的各种蛋白质所带的电荷数量有较大的差异。3.溶液的离子强度

缓冲液离子强度越高，则颗粒的电动电势越小，泳动度也越小。一般最适合的离子强度在0.02-0.2之间。溶液离子强度(ionicstrength)的计算公式如下：

I=1/2Σcz2

式中，I为离子强度，c为离子的摩尔浓度(mol/L),z为离子价数，价数越高，则离子强度越大。如：求0.015mol/LNa2SO4的离子强度。

Na2SO4

2Na++SO42-

I=1/2(0.015×2×12+0.015×22)=0.0454.电渗

电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。如纸电泳时，滤纸吸附OH-离子带负电荷，与纸接触的缓冲液带正电荷向负极移动，会对颗粒的移动造成不良影响，故电泳时，电渗小些为好。

5.温度电泳时会产生焦耳热，使介质粘度下降，分子运动加快，迁移率增加，同时温度过高会使样品中的生物大分子变性失活，因此电泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却散热装置。6.支持物

现代的电泳多在固体支持物上进行，使样品中的不同组分形成不同的区带，称区带电泳。电泳结束后，支持物可以很方便地进行染色等后续处理，因此，使用很广泛。对支持物的一般要求是均匀，吸附力和电渗小，机械性能好，便于染色或紫外光下检测，故最好透明，无紫外吸收。常用的支持物有滤纸，醋酸纤维素薄膜，淀粉凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶等。近年兴起的毛细管电泳可不用支持物，并可与检测装置连接使用。此外，借助两性电解质的等电聚焦，电泳与免疫技术结合的免疫电泳，也是电泳的常用技术。第二节醋酸纤维素薄膜电泳

醋酸纤维是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。将之溶于丙酮等有机溶剂中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度约以0.1-0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度而易碎。目前，国内有醋酸纤维薄膜商品出售，不同厂家生产的薄膜主要在乙酰化、厚度、孔径、网状结构等方面有所不同，但分离效果基本一致。醋酸纤维素薄膜与滤纸相比较，有以下优点：(1)分离效果好。对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了定量测定的精确性。(2)快速省时。由于亲水性较滤纸小，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45-60min即可，加上染色、脱色，整个电泳完成仅需90min左右。(3)灵敏度高，样品用量少。血清蛋白电泳仅需2μL血清，故常用于检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。(4)应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋白等用醋酸纤维素薄膜电泳能较好地分离。(5)易保存，易定量。醋酸纤维素薄膜电泳染色后，经冰乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。由于醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、价廉。目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、酶、多肽、核酸及其他生物大分子。第三节琼脂糖凝胶电泳

一、琼脂糖凝胶的特点天然琼脂(agar)是一种多聚糖，主要由琼脂糖(agarose,约占80%)及琼脂胶(agaropectin)组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。

目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下：(1)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。(2)琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98-99%)，近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。(3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测及定量测定。(4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1μg蛋白质就可检出。琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。二、DNA的琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的相对分子质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。1.核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系

(1)DNA分子的大小：在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。(2)琼脂糖的浓度：如表4-1所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。2.核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系

不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA(covalentlyclosedcircular，简称cccDNA)＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA(一般为球形)不能进入胶中，相对迁移率为0(Rm=O)，而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进(Rm＞O)，由此可见，这3种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。

3.电泳方法

(1)凝胶类型

用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型)。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm，故又称为潜水式。目前更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而受到人们的欢迎。

(2)缓冲液系统

缺少离子时，电流太小，DNA迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和DNA的变性。常用的电泳缓冲液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TAE)，Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等，浓度约为50mmol/L(pH7.5-7.8)，配制方法见附录。电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。TAE缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力，因此更常用。TBE浓溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存5×溶液，用时稀释10倍。0.5×工作也可提供足够的缓冲能力。

(3)凝胶的制备

以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。

(4)样品配制与加样

DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲溶解液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%-10%甘油，以增加其比重，使样品集中。为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U形条带，可改用2.5%Ficoll(聚蔗糖)代替蔗糖或甘油。

(5)电泳

琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明：在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，较大的DNA片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5%时，为增加凝胶硬度，可在4℃，进行电泳。

(6)染色和拍照

常用荧光染料溴乙锭(EB)染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。三、印迹转移电泳

生物化学与分子生物学的研究工作经常需要对电泳分离后的DNA进行分子杂交，但琼脂糖不适合于进行杂交操作，1975年，Southern创造了将DNA区带原位转移到硝酸基纤维素膜(NC膜)上，再进行杂交的方法，被称为Southern印迹法，具体操作方法见实验5-8。随后，Alwine等将类似方法用于RNA印迹，被戏称为Northern印迹，1979年Towbin等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜的装置，将蛋白质转移到膜上，再与相应的抗体等配体反应，被戏称为Western印迹，这种装置将膜和凝胶、滤纸等制成夹心饼干状，用低电压高电流电泳完成转移。1982年Reinhart等用电转移法将等电聚焦后的蛋白质区带从凝胶转移到特定膜上，称Eastern印迹。目前国内外有多种核酸、蛋白质印迹转移的电泳装置出售，使印迹转移速度快、效率高、重复性好，应用更加广泛，仪器的使用方法可参照厂家说明书。聚丙烯酰胺凝胶也可用于印迹转移电泳，但转移蛋白质时，凝胶中不可含有SDS、尿素等变性剂。用于转移电泳的支持膜亦有多种选择，近些年用尼龙膜较多，因为尼龙膜机械性能好，烘烤不变脆，使用时比硝酸纤维素膜更方便。进行印迹转移电泳时，要注意缓冲液的离子强度要低，pH要远离pI，使蛋白质带有较多电荷，一般用稳定性较好的Tris-缓冲体系。还要注意凝胶与支持膜之间不能有气泡。适当提高电压或电流可以提高转移速度，但亦会增加热效应，故电压或电流不可过高。

四、交变脉冲电场凝胶电泳

一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb的DNA。这是因为在琼脂糖凝胶中，DNA分子的有效直径超过凝胶孔径时，在电场作用下，迫使DNA变形挤过筛孔，而沿着泳动方向伸直，因而分子大小对迁移率影响不大。如此时改变电场方向，则DNA分子必须改变其构象，沿新的泳动方向伸直，而转向时间与DNA分子大小关系极为密切。1983年，Schwartz等人根据DNA分子弹性弛豫时间(外推为零的滞留时间)与DNA分子大小有关的特性，设计了脉冲电场梯度凝胶，交替采用两个垂直方向的不均匀电场，使DNA分子在凝胶中不断改变方向，从而使DNA按分子大小分开。后来，Carle等改进了电泳技术，并发现周期性的反转换电场(periodicinversionoftheelectricfield)亦能使大分子DNA通过电泳分开。电泳系统是由一个水平式电泳槽和两组独立，彼此垂直的电极组成，一组电极负极为N，正极为S；另一组负极为W，正极为E。一块正方形琼脂糖凝胶板(10cm×10cm或20cm×20cm)呈45o置于中央，电场在N-S和W-E之间交替建立。电场交替改变的时间长短与欲分离的DNA分子大小有关。电泳时，DNA分子处在连续间隔交替的电场中。首先向S极移动，然后改向E极。在每次电场方向改变时，DNA分子就要有一定的时间松弛，改变形状和迁移方向。只有当DNA分子达到一定构型后，才能继续前进(图4-1)。DNA分子净移动方向与加样线(图中点线)垂直，使样品中各组分沿同一泳道形成各自的区带。交变脉冲电泳可有效分离数百万bp的大分子DNA。较新式的仪器电极间的角度和脉冲时间均可调，使用更加方便。此外，琼脂糖平板常用于免疫扩散技术，和电泳技术相结合的多种免疫电泳。由于涉及免疫学技术，本章不作介绍。第四节聚丙烯酰胺凝胶电泳一、聚丙烯酰胺凝胶的特点

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。

聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。(2)化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应。(3)对pH和温度变化较稳定。(4)几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好。(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。(6)凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定相对分子质量、等电点等。二、凝胶聚合的原理及有关特性

1.聚合反应凝胶的聚合常用过硫酸铵(AP)为催化剂，四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。TEMED的碱基可催化AP水溶液产生游离氧原子，激活Acr单体，使其聚合成单体长链，在Bis作用下，聚合成网状凝胶。碱性条件下凝胶易聚合，室温下7.5%的凝胶在pH8.8时30min聚合，在pH4.3时约需90min。此外，核黄素亦可为催化剂，聚合需光照，故使用不多。2.凝胶孔径的可调性及其有关性质

(1)凝胶性能与总浓度及交联度的关系：凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比。

T(Acr和Bis总浓度)%=[(a+b)/m]×100c(交联剂百分比)%=[b/(a+b)]×100

其中a=Acr克数，b=Bis克数，m=缓冲液体积(mL)。a/b(W/W)与凝胶的机械性能密切相关。当a/b＜10时，凝胶脆而易碎，坚硬呈乳白色；a/b＞100时，即使5%的凝胶也呈糊状，易于断裂。欲制备完全透明而又有弹性的凝胶，应控制a/b=30左右。不同浓度的单体对凝胶性能影响很大，Davis的实验发现Acr＜2%,Bis＜0.5%，凝胶就不能聚合。当增加Acr浓度时要适当降低Bis的浓度。通常，T为2%-5%时，a/b=20左右；T为5%-10%时，a/b=40左右；T为15%-20%时，a/b=125-200左右，为此Richard等(1965)提出一个选择c和T的经验公式；

c=6.5−0.3T此公式适用于T为5-20%范围内的c值，其值可有1%的变化。在研究大分子核酸时，常用T=2.4%的大孔凝胶，此时凝胶太软，不易操作，可加入0.5%琼脂糖。在T=3%时，也可加入20%蔗糖以增加机械性能，此时，并不影响凝胶孔径的大小。(2)凝胶浓度与孔径的关系：T与c不仅与凝胶的机械性能有关，还与凝胶的孔径关系极为密切。一般讲，T浓度大，孔径小，移动颗粒穿过网孔阻力大。此外，孔径还同Acr与Bis的比例有关，Bis占Acr总浓度5%时，孔径最小。

(3)凝胶浓度与被分离物相对分子量质的关系：由于凝胶浓度不同，平均孔径不同，能通过可移动颗粒的相对分子质量也不同，其大致范围如表4-2在操作时，可根据被分离物相对分子质量大小选择所需凝胶的浓度范围。也可先选用7.5%凝胶(标准胶)，因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得较满意的结果。如分析未知样品时也可用4%-10%的梯度胶测试，根据分离情况选择适宜的浓度以取得理想的分离效果。

3.影响凝胶聚合的因素

(1)Acr及Bis的纯度：应选用分析纯的Acr及Bis，两者均为白色结晶物质，λ280无吸收。如试剂不纯，含有杂质或丙烯酸时，则凝胶聚合不均一，或聚合时间延长甚至不聚合，因而需进一步纯化。Acr及Bis固体应避光，贮存在棕色瓶中，因自然光、超声波及γ射线均可引起Acr自身聚合或形成亚胺桥而交联，造成试剂失效。Acr和Bis贮液的pH值为4.9-5.2，当pH值的改变大于0.4pH单位则不能使用，因在偏酸或偏碱的环境中，它们可不断水解放出丙烯酸和NH4+

而引起pH值改变，从而影响凝胶聚合。因此，配制的Acr和Bis贮液应置棕色瓶中，4℃贮存，存放期一般不超过1-2个月为宜。

(2)AP、核黄素、TEMED：是凝胶聚合不可缺少的试剂，AP为白色粉末，核黄素为黄色粉末，应在干燥、避光的条件下保存，其水溶液应置棕色瓶中，4℃冰箱贮存，一般AP溶液仅能存放一周。TEMED为淡黄色油状液，原液应密闭贮于4℃冰箱中。增加AP和TEMED可加快聚合速率，但过量的AP和TEMED会引起电泳时烧胶和谱带变形。应选择合适的配方使聚合在40-60min内完成。(3)pH：碱性条件下聚合较快，但碱性过强时胶硬而脆，需高pH时应减少AP和TEMED用量，制酸性胶可加AgNO3等促进聚合。(4)温度：温度高聚合快，但高浓度凝胶聚合时易产生小气泡，低温(5℃)聚合凝胶会变得脆而混浊，一般25-35℃聚合较好。(5)氧分子：氧分子阻碍凝胶聚合，故不含SDS的凝胶最好先抽真空脱气，再加引发剂。三、PAGE原理

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大类，前者电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；后者电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果更好。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶组成，两层玻璃板中排列顺序依次为上层浓缩胶、下层分离胶。样品液中加入等体积40%蔗糖，防止对流及样品被稀释。浓缩胶其作用是使样品进入分离胶前，被浓缩成窄的区带，从而提高分离效果。分离胶缓冲液为pH8.9的Tris-HCl，大部分蛋白质在此pH条件下带负电荷。蛋白质在此胶中由电荷效应和分子筛效应完成分离。

1.样品浓缩效应(1)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性：凝胶中均有三羟甲基氨基甲烷(简称Tris)及HCl。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH值，是缓冲配对离子。HCl在任何pH溶液中均易解离出(Cl-)，在电场中迁移率快，走在最前面称为快离子。在电极缓冲液中，除有Tris外，还有甘氨酸(glycine)，其pI=6.0，在pH8.3的电极缓冲液中，易解离出甘氨酸根(NH2CH2COO-)，而在pH6.7的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度仅有0.1%-1%，因而在电场中迁移很慢，称为慢离子。大多数蛋白质在pH6.7或8.3时均带负电荷向正极移动，迁移率介于快离子与慢离子之间，电泳开始后，快离子的快速移动会在其后形成一个离子强度很低的低电导区，使局部电位梯度增高，将蛋白质浓缩成狭窄的区带。于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被浓缩成为极窄的区带。当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；因此Cl-及NH2CH2COO-沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于相对分子质量大，被留在后面，由电荷效应及分子筛效应逐渐分成多个区带。

(2)凝胶孔径的不连续性：浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔胶。在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。2.分子筛效应

大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。蛋白质进入pH8.9的同一孔径的分离胶后，分子小且为球形的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面；反之，则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自的区带。这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。3.电荷效应

在pH8.9的分离胶中，各种带净电荷不同的蛋白质有不同的迁移率。净电荷多，则迁移快；反之，则慢。因此，各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及形状，以一定顺序排成一个个区带，因而称为区带电泳。目前，PAGE连续体系应用也很广，虽然电泳过程中无浓缩效应，但利用分子筛及电荷效应也可使样品得到较好的分离，加之在温和的pH条件下，不致使蛋白质、酶、核酸等活性物质变性失活，也显示了它的优越性。进行PAGE时，一般将胶灌在两块玻璃板之间，制成垂直板，垂直板电泳的优越性有：(1)表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，条带更清晰。(2)在同一块胶板上，可同时进行10个以上样品的电泳，便于在同一条件下比较分析鉴定，还可用于印迹转移电泳及放射自显影。(3)胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率高，不仅可用于分析，还可用于制备。(4)胶板薄而透明，电泳染色后可制成干板，便于长期保存与扫描。(5)可进行双向电泳。四、SDS原理

SDS即十二烷基硫酸钠是阴离子去污剂，在水溶液中，以单体和分子团的混合形式存在，单体和分子团的浓度与SDS总浓度、离子强度及温度有关，为了使单体和蛋白质结合生成蛋白质-SDS复合物，需要采取低离子强度，使单体浓度有所升高。在单体浓度为0.5mmol/L以上时，蛋白质和SDS就能结合成复合物；当SDS单体浓度大于1mmol/L时，与大多数蛋白质平均结合比为1.4gSDS/g蛋白质；在低于0.5mmol/L浓度时，其结合比一般为0.4gSDS/g蛋白质。由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用Mr差异将各种蛋白质分开。在蛋白质溶解液中，加入SDS和疏基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。SDS可使蛋白质的氢键、疏水键打开，还引起蛋白质构象的改变。此复合物的流体力学和光学性质均表明，它们在水溶液中的形状近似雪茄形的长椭圆棒。不同蛋白质-SDS复合物的短轴相同，约1.8nm，而长轴则与蛋白质的Mr成正比。

目前，用SDS研究过的蛋白质已有数百种，均证实此法测定蛋白质Mr的可靠性。现在，市场有标准蛋白试剂出售。测定未知蛋白质Mr时，可选用相应的一组标准蛋白及适宜的凝胶浓度，同时进行SDS，则可根据已知Mr蛋白质的电泳迁移率和Mr的对数作出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得Mr。本方法有仪器设备简单，操作方便，样品用量少，耗时少(仅需一天)，分辨率高，重复效果好等优点，因而得到非常广泛的应用与发展。它不仅用于蛋白质Mr测定，还可用于蛋白混合组分的分离和亚组分的分析，当蛋白质经SDS分离后，设法将各种蛋白质从凝胶上洗脱下来，除去SDS，还可进行氨基酸顺序、酶解图谱及抗原性质等方面的研究。

然而SDS也有其局限性，尤其是电荷异常或构象异常的蛋白、带有较大辅基的蛋白(如糖蛋白)及一些结构蛋白等测出的Mr不太可靠。如组蛋白F1，本身带有大量正电荷，虽然结合了正常量的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷，故用SDS测得的Mr为35000，而用其他方法测定的Mr仅为21000。因此要确定某种蛋白质的Mr时，最好用2种测定方法互相验证。尤其是对一些由亚基或两种以上肽链组成的蛋白质，由于SDS及巯基乙醇的作用，肽链间的二硫键被打开，解离成单个肽链，因此测定结果只是单条肽链的Mr，还需用其他方法测定分子中肽链的数目。SDS在凝胶、电极缓冲液中均加进了SDS，蛋白质样品溶解液含有1%SDS和1%巯基乙醇，样品液加样前经过100℃加热4、5min。五、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳原理

蛋白质是两性电解质，当pH＞pI时带负电荷，在电场中向正极移动；当pH＜pI时带正电荷，在电场中向负极移动；当pH=pI时净电荷为零，在电场中既不向正极也不向负极移动，此时的pH就是该蛋白质的等电点(pI)。各种蛋白质由不同的氨基酸以不同的比例组成，因而有不同的pI。利用pI不同，以PAG为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrierampholytes)，在电场作用下，两性电解质载体在凝胶中移动，形成pH梯度，蛋白质在凝胶中迁移至其pI的pH处，即不再泳动而聚焦成带，这种方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(isoelectricfocusing,简释IEF)。1.两性电解质载体

两性电解质载体是用多烯多胺和不饱和酸合成的脂肪族多氨基多羧基化合物的混合物，其中不同的分子因氨基和羧基比例不同而具有不同的pI。目前，两性电解质载体由于生产厂家不同，合成方式各异而有不同的商品名称，如Ampholine(LKB公司)、Servalyte(Serva公司)、Pharmalyte(Pharmacia公司)。一般溶液浓度为40%或20%，其pH范围分别为：2.5-5，4-6.5，5-8，6.5-9，8-10.5，3-10等。用IEF分离蛋白质并测定pI时可先选用pI3-10的两性电解质载体及同一范围的标准pI蛋白，将其与未知样品同时电泳，固定染色后，以pH值为纵轴，距阴极迁移距离(cm)为横轴作出pH梯度标准曲线(图4-2)，根据染色后未知蛋白质迁移距离可推知其pI。为进一步精确测定未知物的pI，还可选择较窄范围的两性电解质进行电泳，以提高分辨率。如实验时，无标准pI蛋白质作标定依据，则电泳后立即用表面微电极每隔0.5cm直接测定胶板的pH值，制作pH梯度曲线，染色后根据迁移距离推知某种蛋白质的pI。两性电解质载体是IEF中最关键的试剂，它直接影响pH梯度的形成及蛋白质的聚焦。因此，要选用优质两性电解质载体，在凝胶中，其终浓度一般为1%-2%。国内生产的两性电解质载体色黄，导电性略差，但只要控制凝胶中终浓度不超过2%，电泳时电压不要太高，仍可用于分析等电聚焦。为提高分辨率可适当延长电泳时间。pH梯度的线性依赖于两性电解质的性质，选择哪种pH梯度范围的两性电解质载体，则与被分离蛋白质的pI有关。2.电极溶液

应选择在电极上不产生易挥发物的液体作为电极缓冲液，阴、阳电极溶液的作用是避免样品及两性电解质载体在阴极还原或在阳极氧化，其pH值应比形成pH梯度的阴极略高，比阳极略低。值得指出的是不同厂家合成两性电解质的方法不同，应根据说明书选用有关电极溶液。表4-4为Pharmacia公司生产的PharmalytepH梯度范围与有关电极液。3.丙烯酰胺的聚合

在采用AP催化化学聚合时，为防止氧分子存在影响聚合，在加AP前应对溶液脱气。此催化系统在碱性条件下容易聚合，在酸性条件下(pH＜5)凝胶聚合比较困难，这可能是在酸性条件下，AP不能充分发生氧原子，使单体成为游离基，因而阻碍凝胶聚合，可在凝胶中加入1%的AgNO3促使凝胶聚合。凝胶聚合后，为防止酶的钝化，在加样前进行15-30min预电泳，然后将样品放在其pI附近。在pH3-10、中性及碱性pH条件下，加入TEMED可加速凝胶聚合，但在pH＜5时无加速作用。TEMED为碱性物质，在pH4.5以上能扩展PAG碱性端pH梯度，其扩增幅度与TEMED加入量有关。郭尧君等人实验表明：在20mL凝胶溶液中，加入50μLTEMED，在距阴极0.3mm处可扩展0.7pH;加入100μLTEMED在阴极处能扩展1.3pH，也就是说pH3.5-9.5的两性电解质载体可扩展到pH3.5-11的梯度范围。因此加入TEMED对碱性蛋白质的分析极为有利，可用于分离细胞色素C、溶菌酶、组蛋白等。

4.样品预处理及加样方法

实验证实盐离子可干扰pH梯度形成并使区带扭曲。例如，将L-氨基酸氧化酶分别溶于不同浓度的NaCl,Tris-HCl及磷酸钠缓冲溶液中，从IEF染色图谱可看出高浓度及低浓度Tris-HCl缓冲液对pH梯度形成影响较小，而NaCl及磷酸钠缓冲液干扰pH梯度形成并使区带扭曲。为防止上述影响，进行IEF时，样品应透析或用SephadexG-25脱盐，也可将样品溶解在水或低盐缓冲液中使其充分溶解，以免不溶小颗粒引起拖尾。但某些蛋白质在等电点附近或水溶液及低盐溶液中，溶解度较低，则可在样品中加入两性电解质，如加入1%甘氨酸或对1%甘氨酸透析，虽然甘氨酸是两性电解质，但不影响pH梯度的形成，可利用其在溶液中的偶极矩作用增加蛋白质的溶解性；也可将样品溶解在含有2%两性电解质载体的溶液中，因它含有可反应的氨基，并能除去氰酸盐，此时样品最好加在经预聚焦的凝胶板的阳极侧，因在pH5以下，既没有氰酸盐也没有氨基甲酰化存在。此外，还可在样品及凝胶溶液中加入非离子去污剂如Tween80,TritonX-100,NonideP40等或加入相同浓度的尿素(4mol/L)，为防止氰酸盐引起蛋白质的氨甲酰化，含有尿素的样品及凝胶板只能当天使用。

加样量则取决于样品中蛋白质的种类、数目以及检测方法的灵敏度。如用考马斯亮蓝R250染色，加样量可为50-150μg；如用银染色，加样量可减少到1μg。一般样品浓度以0.5-3mg/mL为宜，最适加样体积为10-30μL。如样品很浓，可直接在凝胶表面加2-5μL；如样品很稀，可加样300μL。将其放在一特制的塑料小框中或用一小块泡沫塑料及高质量的滤纸或擦镜纸吸取样品放在凝胶表面。由于IEF是按蛋白质pI分离，电泳后各种蛋白质被浓缩并停留在其pI处。因此样品可加在凝胶表面任何位置，既可将样品放在中间，也可放在整个凝胶板中。电泳后均可得到同样的结果。值得指出的是，对不稳定的样品可先将凝胶进行15-30min预电泳，使pH梯度形成，然后将样品放在靠近pI的位置以缩短电泳的时间，但不要将样品正好加在pI处和紧靠阳、阴极的胶面上，以免引起蛋白质变性造成条带扭曲。一般加样电泳半小时后，取出加样滤纸以免引起拖尾现象。5.功率、时间、温度等因素

功率是电流和电压的乘积。在IEF电泳中，样品的迁移越接近pI时，电流越小。为使各组分能更好地分离，就应不断增加电压，缩短pH梯度形成和蛋白质分离所需的时间。但过高的电压会使凝胶板局部范围由于高阻抗而过热烧坏，为此，在电泳过程中，应通冷却水，水温以4-10℃为宜，流量5-10L/min。避免使用过低的温度，以免冷凝水滴形成。超薄板(0,5mm)TFE分辨率高就是因为易冷却。IEF时间与功率取决于多种因素，如聚丙烯酰胺的质量、AP和TEMED用量、胶板厚薄、两性电解质载体的导电性和pH范围。窄pH范围电泳时间比宽pH范围时间长，这是因为在窄pH范围蛋白质迁移接近pI，带电荷少，故迁移慢。为了提高分辨率，就要增加电压，缩短电泳时间，防止生物活性丧失。IFE操作简单，只要有一般电泳设备就可进行，电泳时间短，分辨率高，应用范围广，可用于分离蛋白质及测定pI，也可用于临床诊断，农业、食品研究，动物分类等各种领域。随着其他技术的不断改进，等电聚焦电泳也不断充实完善，从柱电泳发展到垂直板，又进而发展到超薄型水平板等，还可与其他技术如SDS结合，进一步提高灵敏度与分辨率。六、聚丙烯酰胺凝胶双向电泳原理

双向PAGE电泳是由两种类型的PAGE组合而成。样品经第一向电泳分离后，再以垂直它的方向进行第二向电泳。如这二向电泳体系pH及凝胶浓度完全相同，则电泳后样品中不同组分的斑点基本上呈对角线分布，对提高分辨率作用不大。1975年，O’Farrell等人根据不同生物分子间等电点及相对分子质量不同的特点，建立了以第一向为IEF，第二向为SDS-PAGE的双向分离技术，简称为IEF/SDS；基本原理与IEF，SDS完全相同。一般第一向IEF-AGE用超薄水平板，电泳结束后切取所需泳道用于第二向电泳，或在1mm内径的毛细管中进行第一向IEF，取出胶条用于第二向电泳。第一向电泳的方法同IEF-PAGE，只是制胶时要加入2%两性电解质和6mol/L尿素。第二向电泳时，先将SDS-PAG灌在垂直玻璃板之间，上部留2cm左右空间，待聚合后，将第一向胶条转移到第二向胶之上，用载玻片将胶条轻轻压直，加3μL1%溴酚兰指示剂，用1%的琼脂糖(用电极缓冲液配制)密封胶条，琼脂糖凝固后即可电泳。待溴酚兰将至凝胶板下方边缘时，停止电泳。第二向电泳时，用梯度混合器将凝胶制成7.5%-15%的浓度梯度，可以提高电泳的分辨率。目前，已有5，000余种蛋白质分采用IEF/SDS得到很好的分离，其高分辨率是各种类型单向PAGE及其他双向PAGE所无法比拟的。因此，IEF/SDS双向电泳已成为当前分子生物学领域内常用的实验技术，可广泛用于生物大分子如蛋白质，核酸酶解片段及核糖体蛋白质的分离和精细分析，是蛋白质组学的基本方法。随着该技术的不断改进与发展，其应用范围将更加广泛。然而，此技术对某些碱性蛋白质的分离却有其局限性，因在第一向IEF的电泳体系中，含有高浓度的尿素，它的存在会使碱性区的pH梯度变得很窄而且不稳定，可使碱性蛋白质难以进入凝胶中或者易泳出凝胶外。因此，对碱性蛋白质的分离分析应采用其他方法。选出特定的斑点，可用于质谱法测序用质谱法测序：可分析微量的肽链，短肽在第一台质谱仪中经电喷射电离，按荷质比分离，依次在经碰撞池被裂解成离子碎片，在第二台质谱仪中测出各个离子碎片的谱线，推算出短肽的氨基酸序列。在蛋白质组学中应用广泛，但不能区分亮氨酸和异亮氨酸。Edman化学降解法:用此原理已制成蛋白质序列分析仪。若每次循环的准确度为99%，经60次循环，准确度为：0.9960=0.54蛋白质组学研究的其它基本方法根据核苷酸序列推定法：分离mRNA，经反转录测定cDNA的核苷酸序列,再用遗传密码推定氨基酸序列。欧洲生物信息中心研究所和瑞士生物信息研究所共同管理的SWISS-PROT有10多万条肽链的信息；美国国家生物医学基金会主持的PIR