蛋白质的性质实验

蛋白质的性质实验

【目的和要求】1.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。2.了解蛋白质的两性解离性质。初步学会测定蛋白质等电点的方法。3.加深对蛋白质胶体分子稳定因素的认识，了解蛋白质的沉淀反应、变性作用的原理及其相互关系。【实验原理】（一）蛋白质及氨基酸的呈色反应蛋白…【目的和要求】

1.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。

2.了解蛋白质的两性解离性质。初步学会测定蛋白质等电点的方法。

3.加深对蛋白质胶体分子稳定因素的认识，了解蛋白质的沉淀反应、变性作用的原理及其相互关系。

【实验原理】

（一）蛋白质及氨基酸的呈色反应

蛋白质所含有的某些氨基酸具有特殊结构，可以与某些试剂反应，生成有色物质。

1.双缩脲反应

尿素被加热至180℃左右时，两分子尿素缩合放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下可与Cu2+结合生成复杂的紫红色化合物。此反应称为双缩脲反应。所有含有两个或两个以上肽键的化合物均有此反应。

蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双缩脲反应，可用此法鉴定蛋白质的存在或测定其含量。

2.茚三酮反应

蛋白质、多肽和各种氨基酸具有茚三酮反应。除无α-氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色外，其他氨基酸生成紫红色，最终为蓝色化合物。

除蛋白质、多肽和各种氨基酸能进行茚三酮反应外，氨、β-丙氨酸和许多一级胺化合物都有此反应。该反应灵敏度达1：1500000（pH5-7）。现已广泛地用于氨基酸定量测定。

3.黄色反应

凡是含有苯基的化合物都可与浓硝酸反应产生黄色化合物。芳香族氨基酸及含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质分子具有此反应。苯丙氨酸很难反应，需加少量浓硫酸才有黄色反应。

(二)蛋白质的两性反应及等电点的测定

蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。调节溶液的酸碱度达到一定的离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点(pI)。当溶液的pH值低于蛋白质等电点时，即在H+较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为阳离子，当溶液的pH值大于等电点时，即在OH—较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成为阴离子。

本实验采用蛋白质在不同pH溶液中形成的混浊度来确定其等电点，在等电点时蛋白质溶解度最小，最容易沉淀析出。食品检验—氨基酸总量测定蛋白质经水解或酶解可由大分子变成小的pro成分，如水解后的产物经胨，肽等最后成为氨基酸，氨基酸是构成pro最基本的物质。水解后的pro和水解前的pro在物理特性，化学结构以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差别与水解的程度有密切关系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度，也就可以评价食品的营养价值。氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基酸（仪器价格昂贵，不能普遍使用），对于食品来说有时有很多种氨基酸可以同时存在于一种食品中，所以需要测定总的氨基酸量，它们不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基酸态氮）的百分率表示，当然，如果食品中只含有一种氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以从含氮量计算出氨基酸的含量。食品在评价蛋白质的营养价值时，除了测定pro的含量，氨基酸氮含量，还需要对各种氨基酸进行分离，鉴定，尤其对8种人体必需氨基酸进行定量定性分析。一．单指示剂甲醛滴定法：1原理：氨基酸具有酸，碱两重性质，因为氨基酸含有-COOH基，而-COOH基显示酸性，又含有-NH2，-NH2则显示碱性，由于-COOH基和-NH2的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐，当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就可用碱来滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的量，反应式以三种形式存在。用碱完全中和-COOH基时的PH值为8.4~9.2。2试剂：（1）40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，将甲醛用1NNaOH溶液中和（淡兰色）。（2）0.1%百里酚酞乙醇溶液。（3）0.100NNaOH标准溶液。3操作步骤：称约含20mg左右的氨基酸→于烧杯中（如为固体样加水50ml）→加两滴指示剂→用0.1NNaOH溶液滴定到淡兰色→加中性甲醛20ml→摇匀→静置1分钟→此时兰色应消失→再用0.1NNaOH溶液滴定淡兰色，记录两次滴定所消耗的碱液毫升数。计算：氨基酸态氮=（N×V×0.014×100）/W×100二．双指示剂甲醛滴定法1原理：与单色法相同，只是在此法中使用了两种指示剂，从分析结果看，双指示剂甲醛滴定法与亚硝酸氮气容量法（此法操作复杂，但准确，不作介绍）相近，单色滴定法稍偏低，主要因为单指示剂甲醛滴定法是以氨基酸溶液的PH值作为中性红的终点，PH值为7.0，从理论计算看，双色滴定法比单色滴定法准确。2试剂：同单指示剂一样，多一个0.1%中性红（50%乙醇溶液）3操作步骤：取相同两份样品→分别于100ml三角瓶→一份加中性红2滴→用0.1NNaOH滴定终点（由红变琥珀色），记录用量，另一份加百里酚酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml→摇匀→用0.1NNaOH滴至淡兰色。计算：氨基酸态氮=（N×（V2-V1）×0.014×100）/W×100V1——用中性红为指示剂时，碱液所消耗的体积V2——用百里酚酞乙醇液为指示剂时标液消耗量0.014——氮的毫克当量浓度注意事项：（1）单色指示剂甲醛滴定法，用碱完全中和—COOH基时的pH为8.5—9.5（2）测定样品的颜色较深，应加活性炭脱色之后再滴定三．茚三酮比色法：1原理：氨基酸在一定pH范围内，能与茚三酮生成兰紫色化合物。可以用比色法定量测定。2试剂：（1）磷酸缓冲液（pH.8.04）制备方法如下：称磷酸二氢钾4.5350g。定容500ml称NAH2PO4·12H2O11.9380g分别溶解定容500ml取磷酸二氢钾10ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液（2）2%茚三酮溶液：称茚三酮1g→溶于35ml热水→加入40mg氯化亚锡（SnCl2·H2O）搅拌过滤（作防腐剂）→于冷暗处过夜→定容50ml①氨基酸标液称干燥氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g→溶解定容100ml→摇匀→吸10ml于另外100ml容量瓶定容100ml，即得200Ug/ml标液3操作方法：（1）绘制标准曲线：取7个25ml容量瓶，吸取标液00.51.01.52.02.53.0ml于7个25ml容量瓶，加水补充至容积为4ml，然后加茚三酮和缓冲液各1ml，于水浴加热15分钟，冷却后定容25ml，静置15分钟，在570nm下测消光值，绘制标准曲线。（2）样品测定：取样品5.00~10.0g（液体样5-10ml）→于烧杯中→加50ml水和活性碳约5g→加热过滤→用30—40ml热水洗涤活性炭→吸澄清样液1~4ml→加茚三酮和缓冲液各1ml水浴加热15分钟，冷却定容，静置15分钟于570nm下测定消光值，按下式计算氨基酸含量。氨基酸含量（毫克/100克）=C/（W×1000）×100C——从标准曲线上查得得氨基酸的量（Ug）W——测定得样品溶液相当于样品的量（g）注意事项：茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易被氧化呈淡红或深红色，使用前要进行纯化，方法如下：、取10g茚三酮容于40ml热水中，加一克活性炭，摇匀静置30分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过滤，即出现兰色结晶，过滤，用2ml冷水洗涤结晶，置干燥皿中干燥，装瓶备用。思考题：1试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的