第六章 酶分子的化学修饰

第五章酶分子的化学修饰酶的修饰共价修饰非共价修饰化学修饰遗传修饰酶的化学修饰：在体外将酶分子通过人工方法与一些化学基团进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。从广义上说，凡通过化学基团的引入或除去，都可称为酶的化学修饰。

意义：1.基础酶学的研究；活性部位的研究一级结构的测定测定酶分子中某种氨基酸的数量。结构与功能的关系2.提高生物活性；3.增强稳定性；4.产生新的催化能力;5.解除免疫原性；第一节酶分子的修饰方法

一、酶的表面修饰酶分子表面的功能基：羧基、氨基、巯基、羟基、咪唑基等（一）小分子修饰：常用的小分子化合物主要：氨基葡萄糖、乙酸酐、硬脂酸、邻苯二酸酐、乙酸-N-丁二酯亚胺酯等例：α-胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰一NHCH2COOH后，稳定性在60℃可提高1000倍。马肝醇脱氢酶的赖氨酸的乙基化、糖基化和甲基化都能增加其活力，同时酶稳定性也提高许多，底物专一性也有所改变。（二）大分子修饰

可溶性大分子：如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸(PAA)、聚氨基酸、右旋糖苷、环糊精、肝素等。例：PEG修饰的L-天冬酰胺酶免疫原性显著降低、半衰期延长。天然过氧化氢酶在6h内很快从血液中被去，PEG修饰后，酶活力在血液循环中可保持72h右旋糖苷修饰α-淀粉酶：60℃,t1/2：3.5min；修饰后：175minMPEG修饰过氧化氢酶，三氯乙烷中酶活是原来的200倍。（三）交联修饰使用双功能或多功能试剂将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同肽链部分间进行共价交联。（四）固定化修饰例：枯草杆菌蛋白酶交联酶晶体，其酶活提高13倍。葡聚糖二乙醛交联青霉素G酰化酶，55℃下的半衰期提高9倍。丝氨酸氨白酶、胰蛋白酶通过交联修饰，最适温度从45℃提高到76℃。

小分子修饰：稳定性增加及一定催化特性的改变。大分子修饰：稳定性增加；提高在非水相中的催化能力；免疫原性与抗原性降低、延长半衰期。交联修饰：提高其稳定性，增加酶在非水溶液中的使用价值。

二、酶分子的内部修饰（一）催化活性基团的修饰产生新的催化能力硫代烷基化反应，枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser转化为半胱氨酸，对肽或酯无水解能力，但能水解硝基苯酯。化学突变：将一种氨基酸侧链化学转化为另一种新的氨基酸侧链的方法。（二）非催化活性基团的修饰改变酶的动力学特征、影响酶的专一性。胰凝乳蛋白酶，Met192氧化成亚砜，该酶对含芳香族或大体积脂肪族的专一性底物的Km提高2-3倍。（三）

蛋白质主链的修饰依靠酶法，水解部分酶片断。天冬氨酸酶有限水解切去10个氨基酸后，酶活提高5.5倍

（四）

与辅因子相关的修饰

1．依赖辅助因子的酶①

辅因子共价结合在酶上；

NADH共价结合到醇脱氢酶，活力为原来的40%,但解决了辅因子循环利用的问题。

②引入新的辅因子或对辅助因子进行修饰。例：黄素共价结合在木瓜蛋白酶上，从而将蛋白酶转变成氧化原酶。

修饰辅助因子，可创造出多种多样的新酶。2.金属酶中的金属取代酶分子中的金属取代可以改变酶的专一性、稳定性及其抑制作用。例：酰化氨基酸水解酶活性部位中的锌被钴取代后，酶的底物专一性和最适pH都有改变。第二节

酶蛋白侧链的小分子修饰

一、巯基的化学修饰烷基化试剂：有卤代乙酸、芳香卤、芳香族磺酸。常用的有碘代乙酸和碘乙酰胺、巯基乙醇。有机汞试剂：对氯汞苯甲酸(pCMB)专一性最强，修饰产物在250nm处有最大吸收。

5，5’-二硫代-双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）(Ellman试剂)，反应生成的阴离子在412nm处有最大吸收。定量酶分子中巯基数目最常用的试剂。N-乙基马来酰亚胺(NEM)：反应专一性很强的疏基修饰剂，反应产物在300nm处有最大吸收。二、氨基的化学修饰烷基化试剂：

碘代乙酸

三硝基苯磺酸（TNBS）：与赖氨酸残基反应，420nm，367nm能产生特定的光吸收。磷酸毗哆醛(PLP)是一种非常专一的赖氨酸修饰试剂，反应可通过325nm处光吸收定量。2,4-二硝基氟苯（DNFB）法(又称sanger试剂)；丹磺酞氯(DNS)法；苯异硫氰酸酯(PITC)法。用于多肽链N-末端残基的测定的化学修饰方法。

三、羧基的化学修饰水溶性的碳二亚胺类特定修饰酶的羧基已成为最普通的标准方法，在一定条件下，丝氨酸、半胱氨酸和酪氨酸也可以反应。四、咪唑基的化学修饰焦碳酸二乙酯(DPC)和碘代乙酸。DPC对组氨酸残基有较好的专一性，产物在240nm处有最大吸收，可跟踪反应和定量。DPC还可能修饰巯基，用连四硫酸钠或连四硫酸钾对巯基进行可逆地保护。五、吲哚基的化学修饰N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)：产物可通过280nm处光吸收的减少跟踪反应。2-羟基-5-硝基苄溴(HNBB)和4-硝基苯硫氯对吲哚基修饰比较专一。但易与巯基作用，修饰时应对巯基进行保护。

六、二硫键的化学修饰二硫苏糖醇（DTT）巯基乙醇

七、酚基的化学修饰四硝基甲烷（TNM）：最常用的具高度专一性酪氨酸残基的修饰剂。苏氨酸和丝氨酸残基：一般都可被修饰酚羟基的修饰试剂所修饰；二异丙基氟磷酸（DFP）对丝氨酸有高度反应性。

八、胍基的化学修饰常用丁二酮、1，2-环己二酮、苯乙二醛。4-羟基-3-硝基苯乙二醛（405nm）对硝基苯乙二醛（340nm）具有光吸收性质，并且产物具有旋光性，特别适合于精氨酸的定量。化学修饰反应的类型

1)烷基化反应试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。可作用基团：氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。修饰剂：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。

烷基化反应

2)酰基化反应试剂特点：含有结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。可作用基团：

氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟基（Tyr）

酰基化反应

3)氧化和还原反应试剂特点：具有氧化性或还原性。氧化剂：H2O2可被氧化的侧链基团:巯基，甲硫基，等。还原剂：2－巯基乙醇、DTT等。可被还原的侧链基团：二硫键。氨基酸侧链基团修饰剂Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亚胺Arg胍基苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮Cys巯基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺二硫键巯基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羟基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亚胺

各种氨基酸侧链的修饰剂第三节

酶蛋白侧链的大分子修饰

常用修饰剂：聚乙二醇(PEG)、右旋糖苷、环糊精、蔗糖聚合物(Ficoll)、肝素、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸(PAA)、聚氨基酸、等。活化：修饰剂的活化，即制备修饰剂衍生物。偶联：与酶蛋白偶联反应。proteinHalflifeinvivo(h)Injections/weekα-IFNβ-IFNHGHEPOG-CSFGM-CSF5.60.60.3652337377各类蛋白类药物的体内半衰期及注射次数IFN-α2aand40kDa(PEG)–IFN-α2a的药代动力学

酶

半衰期相对稳定性

天然SOD6min1

右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240

聚乙二醇-SOD35h350蛋白类药物修饰后的半衰期及稳定性1.PEG（PolyethyleneGlycol）简介：①

具有两亲性;②

无毒，免疫原