第四章 高效液相色谱

补充：仪器分析新闻1：今年2月4日，青岛市民林某从菜市场买回3公斤叶子丰茂、色泽青绿的韭菜。晚上，一家人饱食了一顿自己包的韭菜饺子。谁知，食后时间不长，夫妻俩及2岁的女儿相继出现腹痛、腹泻、恶心呕吐等症状，体质虚弱的林妻浑身乏力、视物不清。经医护人员及时输液、解毒处理，三人终于脱险。据查，此为因食用含有大量残留农药的韭菜而中毒。新闻2：家住成都跳蹬河南路小区的张雪梅女士元旦期间遇上了麻烦：新年第一天，她到跳蹬河农贸市场买回白菜烧汤喝，饭后全家人都出现不同程度的头痛、呕吐现象。疑云重重的她把没吃完的菜拿到成华区农技站去检验，结果吓了一大跳：原来残留的甲胺磷农药每公斤小白菜高达35.12毫克，含量超出国家规定最大允许残留量的3倍多！咱们讨论一下：看到这篇报道有什么想法，应该做些什么，如何避免这种情况的发生？讨论结果：对蔬菜的残留农药量进行分析检测再讨论：那用什么方法呢？化学分析法行吗？不能用化学分析法，为什么？蔬菜中农药的残留量比较低；蔬菜中农药的种类比较多，定性定量困难通常使用仪器分析，借助特殊的仪器，比如色谱仪定义与区别仪器分析法是以测量物质的物理或物理化学性质为基础的分析方法。比化学分析方法：检验速度快灵敏度高涉及领域兴奋剂的英文词是doping,源于非洲某部落的一种方言，原意是指使人兴奋的高度。最早是在1963年由欧洲体育联合会提出的。早在古希腊奥林匹克运动会时，人们就知道通过服用草药、蘑菇及其他植物性饮料能发挥更大的运动潜能。一、体育（兴奋剂）1.为什么运动员比赛时不能服用兴奋剂?

食用兴奋剂可以使自己不疲乏、累，保证了运动员在比赛时减少了体力的消耗。2.服用兴奋剂对运动员在比赛时取得成绩有多大的帮助?为什么?

兴奋剂可以使人变的兴奋，从而对运动员有减少体力消耗的作用。3.兴奋剂是一和什么样的药物?它的真正名称是什么?

有兴奋作用的就叫兴奋剂,大多都含氯安酮的,其中大麻也有兴奋的作用.

4.服用兴奋剂会不会有什么负作用?会不会产生依赖?

负作用一定会有的,例如虚脱疲劳过度等

5.兴奋剂可不可以在药店里买到?

大型的药店能买到的,大多为精神科处方药6.兴奋剂对快速恢复体能有帮助吗?

没有7.是不是任何人都可以服用兴奋剂?可以，可乐中也含有一定的兴奋剂。

(1)刺激剂共计51种，是禁用药物最多的一类。由于考虑到许多抗感冒、治鼻炎的药物中都含有麻黄碱类物质，因此现在对麻黄碱一类药物作了量的限制。(2）麻醉剂9种。此外，对吗啡增加了定量的要求，在尿液中超过1mg/L为阳性。(3)阻断剂20种(4）利尿剂14种。(5）蛋白同化制剂31种。(6)掩蔽剂指能够破坏禁用物质的排泄或能掩盖尿样中其他禁用物质的药物。

(7）抗雌激素制剂包括氯米芬等。该类药物仅男性禁用。(8)肽类激素及其模拟物和类似物。这也是新禁用的类别。二、生活产品质量（鱼新鲜度、食品添加剂、农药残留量）添加剂包括：防腐剂、增稠剂、着色剂、调味剂、抗氧化剂、乳化剂常见：山梨酸钾、苯甲酸钠三、法庭化学（DNA技术）法医学研究方法分四类:医学类、生物学类、化学类、物理类ICP质谱仪

分析绝大部分的金属元素和部分非金属元素

岛津GC-2010

气相色谱仪HP-1100液相色谱仪X射线光电子能谱仪X射线荧光仪UV光谱仪日立F-4500荧光光谱仪扫描俄歇微探针简介俄歇电子具有特征性能量，其能量与释放俄歇电子的原子中的电子转移有关。俄歇电子的释放是释放特征性x射线的替代形式。

电子顺磁共振仪荧光光谱仪LS-50B第四章高效液相色谱法回顾：色谱法概述一、色谱法的由来1．1906年由俄国植物学家Tsweet创立

植物色素分离见图示

2．现在：一种重要的分离、分析技术分离混合物各组分并加以分析

固定相——除了固体，还可以是液体

流动相——液体或气体被分离组分——不再仅局限于有色物质图示固定相——CaCO3颗粒流动相——石油醚

色带二、色谱法定义、实质和目的

定义：利用物质的物理化学性质建立的分离、分析方法实质：分离目的：定性分析或定量分析三、分类：1．按两相分子的聚集状态分：流动相固定相类型液相色谱液体固体液-固色谱液体液体液-液色谱气体固体气-固色谱气体液体气-液色谱气相色谱续前2．按操作形式分类：3．按分离机制分：

纸色谱薄层色谱柱色谱

分配色谱：利用分配系数的不同

吸附色谱：利用物理吸附性能的差异

离子交换色谱：利用离子交换原理

空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同三、色谱过程、分离原理及特点（一）色谱过程指被分离组分在两相中的“分配”平衡过程以吸附色谱为例见图示

吸附→解吸→再吸附→再解吸→反复多次洗脱→被测组分分配系数不同→差速迁移→分离图示吸附能力的差异→吸附能力弱的组分先流出；吸附能力强的组分后流出续前（二）色谱分离原理色谱分离基于各组分在两相之间平衡分配的差异，平衡分配可以用分配系数和分配比来衡量四、基本类型色谱法的分离机制基本概念：固定相（s）；流动相（m）（一）吸附色谱法（二）分配色谱法（三）离子交换色谱法（四）空间排阻色谱法（一）吸附色谱法要求：固定相→吸附剂（硅胶或AL2O3）

具表面活性吸附中心分离机制：见图示分离机制：各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离图示吸附→解吸→再吸附→再解吸→无数次洗脱→分开（二）分配色谱法要求：固定相→机械吸附在惰性载体上的液体流动相→必须与固定相不为互溶载体→惰性，性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反应分离机制见图示

分离机制利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离图示（三）离子交换色谱法要求：固定相→离子交换树脂流动相→水为溶剂的缓冲溶液被分离组分→离子型的有机物或无机物分离机制见图示分离机制：

依据溶质与离子交换剂亲和力不同而实现分离图示（四）空间排阻色谱法要求：固定相→多孔性凝胶流动相→水或有机溶剂分离机制见图示分离机制：利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离图示结论：四种色谱的分离机制各不相同，分别形成吸附平衡、分配平衡、离子交换平衡和渗透平衡K分别为吸附系数，分配系数，选择性系数和渗透系数图示第一节概述1、高效液相色谱高效在哪儿？2、给你一个色谱图，你能标出图中所有的术语吗3、色谱柱参数很重要，都包括了什么呢4、什么是分离度，怎样能有理想的色谱分离效果1、高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较

高速：HPLC采用高压输液设备，流速增加，分析速度极快，只需数分钟而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高灵敏度：检测器灵敏度极高

UV—10-9g,荧光检测器—10-11g。2、HPLC与GC差别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测主要差别：分析对象的差别和流动相的差别（1）操作条件差别

GC：加温操作

HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）（2）流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用

HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用3、高效液相色谱仪流程图1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2．高压泵（输液泵）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置4、HPLC的特点和应用

“三高”“一快”“一广”

高柱效——n=104片/米，柱效高高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广泛（可分析80%有机化合物）二、高效液相色谱仪简介

1.贮液瓶2.高压输液泵3.进样器4.色谱柱

5.检测器6.记录装置基本构造简介1贮液器

要求：（1）必须有足够容积，以备重复分析使用（2）脱气方便，能耐一定压力（3）所用材质对所用的溶剂是惰性的溶剂脱气系统：为什么需要脱气？防止在检测器中产生气泡，引起噪音。除去氧气的影响。可采用：超声波脱气真空加热脱气2输液泵A、恒压泵：气动放大泵B、恒流泵：目前普遍采用往复式恒流泵3梯度洗脱装置低压梯度装置：混合后进高压泵高压梯度装置：进高压泵后再混合梯度洗脱装置：

在分离过程中逐渐改变流动相组成（溶剂极性、离子强度、pH等）或改变流动相浓度的装置。4进样装置：六通进样阀是目前多采用的进样方式1）手动进样器：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。装入样品出口进样采样环泵入溶剂进色谱柱2）自动进样器5色谱柱（区别体现在柱长和内径）柱管材料：耐腐蚀耐压，常用不锈钢管内径：2.0、3.0、4.1、4.6mm长度：5、10、15、25cm等固定相：颗粒细、圆、均一、刚性强

6控温系统7检测器要求：高灵敏、快响应、宽线性、低噪音、小体积类型：A、通用检测器：示差折光检测器（RID）、蒸发光检测器（ELSD）B、非通用型检测器：紫外检测器（UVD）、荧光检测器（FD）、电化学检测器（ECD,如电导检测器是离子色谱的通用型检测器）紫外吸收检测器(ultravioletdetector,UVD)：固定波长紫外吸收检测器：低压汞灯提供固定254nm或280nm紫外光。可变多波长检测器：氘灯做光源，光栅分光光二极管阵列检测器：钨灯和氘灯组合光源，进入检测池的不是单色光，而是一段紫外波长上的光。。折光指数检测器（refractiveindexdetector,RID）：也称为示差折光检测器。溶液的折射率等于溶剂及其中所含各组分溶质的折射率与其各自的摩尔分数的乘积之和。RID是通用型的检测器，但是灵敏度不高。RID不能用于梯度洗脱，必须在恒温条件下使用。蒸发光散射检测器(evaporativelight-scatteringdector,ELSD)恒定流速的色谱仪洗脱液——被高压气流雾化——进入蒸发室（流动相及低沸点的组分被蒸发）——剩下的高沸点组分的小液滴进入散射池——光束穿过被散射——散射光被光电管接收形成电信号——电信号通过放大电路、模数转换电路、计算机成为色谱工作站的数字信号——色谱图。

热学性质：光声检测器热透镜和光热偏转检测器8、数据处理系统三、HPLC的特点速度快分辨率高灵敏度高柱子可反复使用第二节基本理论（一）色谱流出曲线和相关术语1、死时间t0流动相通过色谱柱时间2、死体积V0柱中溶剂总体积（二）保留值3．保留时间tR：从进样开始到某组分色谱峰顶（浓度极大点）的时间

即溶质在色谱柱中的停留时间或溶质流经色谱柱所需要的时间。

4、保留体积

VR(ml)=tR(min)*Fc(ml/min)VR=Vm+KVs

K--平衡分配系数,Vs--固定相体积,Vm=流动相所占体积

溶质在固定相中的浓度(ns/Vs)nsVmK=----------------------------------=----*----

溶质在流动相中的浓度(nm/Vm)nmVs

ns,nm溶质在固定相和流动相中的量(3)调整保留时间

tR´=tR-toVR’=VR–V0（三）色谱柱参数分配系数k1、相平衡参数容量因子k’2、柱选择性参数（α）3、柱效参数分配系数K相平衡常数：指在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达分配平衡后，在固定相与流动相中的浓度比容量因子(k’)

固定相中的量(Ms)k´=------------------------流动相中的量(Mm)

K=k´(Vo/Vs)VR=Vo+KVs=Vo+k´(Vo/Vs)Vs=Vo+k´Vo=Vo(1+k´)

tr=to(1+k´)k´=tR/to-1

k´越小，保留时间越短.相对保留值()

=tR'(2)/tR'(1)=k´(2)/k´(1)样品中各组分分配系数和容量因子不等，也就是α≠1，是色谱分离的前提越大，分离效果越好柱效参数：塔板理论-色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：

n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：有效塔板数和有效塔板高度

单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：三、分离度（五）分离度R(分辨率)相临两组分间峰顶间距离是峰底宽平均值的几倍,衡量色谱分离条件优劣的参数讨论：例题1：

在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为85秒和100秒，要达到完全分离，即R=1.5。计算需要多少块有效塔板。若填充柱的塔板高度为0.1cm，柱长是多少？解：α=100/85=1.18

n有效=16R2[α/(α—1)]2

=16×1.52×(1.18/0.18)2

=1547（块）L有效=n有效·H有效

=1547×0.1=155cm

即柱长为1.55米时，两组分可以得到完全分离。例题2：

在塔板数为3600块/米条件下，两个组分的保留时间分别为12.2s和12.8s，计算分离度。要达到完全分离，即R=1.5，所需要的柱长。解：分离度：塔板数增加一倍，分离度增加多少？［例3］有一根lm长的柱子，分离组分1和2得到如图18d5的色谱图。图中横坐标l为记录笔走纸距离。若欲得到R=1．2的分离度，有效塔板数应为多少？色谱柱要加到多长？什么是速率理论速率理论有哪些重要参数什么是内标法，什么是外标法四、速率理论-影响柱效的因素速率方程（也称范.弟姆特方程式）:

H=A+B/u+C·u

H：理论塔板高度，u：载气的线速度(cm/s)

减小A、B、C三项可提高柱效；存在着最佳流速；

A、B、C三项各与哪些因素有关？1.涡流扩散项－A同种组分分子