高效液相色谱法同步测定败酱草败酱中的3种成分

高效液相色谱法同步测定败酱草败酱中的3种成分

湿草是指湿科多年生草本植物的后代，以及白色斑点草。神农本草经分为中产品，是一种古老而常用的中药。药理研究表明,败酱草具有清热解毒、排脓破瘀、活血化瘀之功效。其化学成分主要是三萜皂苷类,其苷元类型主要为常春藤皂苷类、齐墩果酸皂苷类、熊果酸皂苷类化合物,其次是黄酮类、环烯醚萜类、香豆素类、甾醇类、挥发性化合物类等化合物。其中三萜皂苷类成分是败酱草的主要有效成分,临床药理活性证明,其齐墩果酸、熊果酸和常春藤皂苷元都具有抗菌消炎、利尿抗水肿、抑制肿瘤细胞生长、保肝、降酶、提高机体免疫力的作用。1977年版《中国药典》曾收录了败酱草,标准仅有性状鉴别和化学鉴别,而化学鉴别的泡沫反应专属性不强。该品种在以后的药典中未收载。为了全面评价该常用药材的质量,有必要对败酱草药材中的三萜皂苷类成分进行定量分析。但目前文献中关于败酱草三萜皂苷成分的含量测定研究主要针对齐墩果酸和总皂苷。本实验采用高效液相色谱法,建立了同时测定败酱草中常春藤皂苷元、齐墩果酸、熊果酸3种成分的方法,为败酱草的质量控制提供科学依据。1材料表面1.1败酱草的选择常春藤皂苷元对照品(南昌贝塔生物科技有限公司,批号10085-200912)、齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号110709-200304),熊果酸对照品(南昌贝塔生物科技有限公司,批号10481-200917);收集了不同购买地的败酱草样品,其药材均经我院中药资源教研室付小梅老师鉴定,其中福建同春药业股份有限中药分公司、南京国盛连锁药店和安徽亳州购买的败酱草为黄花败酱PatriniascabiosaefoliaFisch.exLink、其余都为白花败酱P.villosaJuss。甲醇为色谱纯试剂,水为三蒸水,其他试剂均为分析纯。1.2超声清洗器、高速多功能粉碎机安捷伦1200型高效液相色谱仪,BS214D型电子天平(厂家为Sartorius公司),KQ-500B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),SL-100型高速多功能粉碎机(浙江省永康市松青五金厂),蒸发皿,水浴锅。2方法和结果2.1溶液的制备2.1.1对照品溶液的制备分别精密称取常春藤皂苷元、齐墩果酸和熊果酸对照品适量,加甲醇制成常春藤皂苷元质量浓度为0.52g·L-1、齐墩果酸质量浓度为0.82g·L-1、熊果酸质量浓度为0.79g·L-1的对照品溶液。临用时精密移取适量各对照品溶液混匀,即得混合对照品溶液。2.1.2制备工艺的制备取败酱草药材粉末(过4号筛)2g,精密称定,置具塞锥形瓶,加甲醇50mL,超声提取60min,滤过,残渣用甲醇适量洗涤,合并滤液与洗液,蒸干,残渣加水10mL溶解,用水饱和正丁醇萃取3次,每次20mL合并提取液,蒸干,残渣加甲醇20mL,盐酸4mL加热水解4h,水解物加水10mL,用三氯甲烷振摇提取2次,每次20mL,合并提取液,蒸干,残渣加甲醇溶解并定量转移至10mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。2.2u3000酸铵氧化法UltimateC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相A为甲醇,B为0.2%乙酸铵水溶液,梯度洗脱程序(0~15min,80%A,20%B;15~25min,80%~95%A,20%~5%B;25~30min,95%A,5%B);检测波长210nm,流速1mL·min-1,柱温25℃。对照品和样品色谱图见图1。2.3标准曲线的绘制分别精密吸取适量常春藤皂苷元、齐墩果酸和熊果酸对照品溶液,加甲醇配制不同浓度的对照品混合溶液,分别取上述溶液各20μL,按上述色谱条件测定峰面积,以峰面积为纵坐标,质量浓度为横坐标绘制标准曲线并进行回归计算,常春藤皂苷元、齐墩果酸和熊果酸的回归方程分别为Y=7748.7X-9.6066(r=0.9999),Y=6830.9X+74.347(r=0.9998),Y=4544.2X+316.66(r=0.9998),分别在0.026~0.26,0.082~0.82,0.079~0.79g·L-1具有良好线性关系。2.4回复进样精密度试验精密吸取上述对照品溶液,按上述色谱条件重复进样6次,测定峰面积,结果表明,常春藤皂苷元、齐墩果酸和熊果酸的RSD分别为0.78%,1.19%,0.60%,精密度良好。2.5溶液稳定性检测取同一供试品溶液,分别于0,4,8,12,16,24h进样测定峰面积,结果表明,样品中常春藤皂苷元、齐墩果酸和熊果酸峰面积的RSD分别为1.32%,1.61%,2.60%(n=6),表明供试品放置24h基本稳定。2.6高效液相色谱条件取同一产地败酱草样品(1号样品)6份,每份约2g,分别精密称定,照2.1.2项下操作,按上述高效液相色谱条件测定。常春藤皂苷元、齐墩果酸和熊果酸的RSD分别为1.52%,1.82%,1.96%,表明该方法重复性良好。2.7相对高效液相色谱条件测定常春藤皂苷元、齐墩以熊乳酸、创新各带醇液制备所需溶液量为导向,制备所需溶液取已知含量的(1号样品)败酱草6份,每份1.0g,精密称定,分别精密加入常春藤皂苷元、齐墩果酸和熊果酸对照品适量,照2.1.2项下方法操作制备所需溶液,按上述高效液相色谱条件测定。结果见表1。2.8样品测定取所收集的败酱草样品,按供试品溶液制备方法制备供试液,按上述高效液相色谱条件测定,计算含量,结果见表2。3讨论3.1检测波长的确定取对照品溶液,在585~190nm波长进行光谱扫描,结果常春藤皂苷元、齐墩果酸、熊果酸在210nm处均有最大吸收,故采用210nm为检测波长。3.2不同系统流动相的分离常春藤皂苷元、齐墩果酸与熊果酸均为五环三萜,其中齐墩果酸与熊果酸为同分异构体,结构和性质均极其相似,在药材中往往共生互存,分离测定较为困难。本实验在参考相关文献[10-14]基础上,考察了不同系统的流动相,包括乙睛-水、甲醇-水、甲醇-水-磷酸-三乙胺、甲醇-水-冰醋酸-三乙胺系统,结果均未得到良好的分离。经反复实验,以甲醇-0.2%乙酸铵水溶液体系为流动相,采用梯度洗脱方法,齐墩果酸和熊果酸分离较好,故选用甲醇-0.2%乙酸铵水溶液作为流动相。3.3不同购买地的败酱草样品的含量测定对包括超声提取法、回流提取法和冷浸法3种提取方式进行了考察,结果表明,采用超声提取时,常春藤皂苷元、齐墩果酸和熊果酸的提取率最高,且该方法简单易行;另对超声提取条件如提取溶剂、溶剂用量及超声时间进行考察,当采用50mL80%的甲醇超声,每次60min时,常春藤皂苷元、齐墩果酸和熊果酸的提取率最高;同时考察水解条件,盐酸的用量、水解温度及水解时间,结果表明,盐酸用量为4mL在90℃水浴回流水解4h时,常春藤皂苷元、齐墩果酸和熊果酸的提取率较高。测定了10批不同购买地的败酱草样品的含量,结果表明,不同购买地的败酱草样品中常春藤皂苷元、齐墩果酸和熊果酸的含