第九章 微生物的突变和诱变育种

第九章微生物的突变和诱变育种第一节微生物的突变第一节微生物的突变一、基因突变（genemutation）基因突变简称突变，是变异的一类，泛指细胞内（或病毒粒内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。突变的几率一般很低（10-6~

10-9）从自然界分离到的菌株一般称野生型菌株（wildtypestrain），简称野生型。野生型经突变后形成的带有新性状的菌株，称突变株（mutant，或突变体、突变型）。

凡能用选择性培养基（或其他选择性培养条件）快速选择出来的突变株称选择性突变株（selectablemutant），反之则称为非选择性突变株。（一）突变类型1、营养缺陷型（auxotroph）某一野生菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法再在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。2、抗性突变型（resistantmutant）指野生型菌株因发生基因突变，而产生的对某化学药物或致死物理因子的抗性突变类型。3、条件致死突变型(conditionallethalmutant)某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下可正常地生长、繁殖并呈现其固有的表型，而在另一种条件下却无法生长、繁殖的突变类型。4、形态突变型(morphologicalmutant)

指由突变引起的个体或菌落形态的变异，一般属非选择性突变。5、抗原突变型(antigenicmutant)

指由于基因突变引起的细胞抗原结构发生的变异类型，包括细胞壁缺陷变异、荚膜或鞭毛成分变异等。6、产量突变型(metabolicquantitativemutant)

通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株，称产量突变型。有两种类型：正变株（plus-mutant）、负变株（minus-mutant）（二）突变率（mutationrate）

某一细胞（或病毒粒）在每一世代中发生某一性状突变的几率，称突变率。（三）基因突变的特点1.自发性：各种突变都可在无人为诱变因素处理下自发发生；2.不对应性：突变的性状与引起的原因间无直接对应关系；3.稀有性：自发突变的几率极低，一般10-6-10-9，但稳定；4.独立性：某一突变既不提高也不降低其他任何基因的突变率；5.可诱变性：诱变剂可提高突变的几率，两种变异株无本质差别；6.稳定性：是遗传物质结构上发生了稳定的变化，稳定，可遗传；7.可逆性：任何性状都可发生正向突变，也都可发生回复突变。（四）基因突变自发性和不对应性的实验证明

1、Luria等的变量试验（fluctuationtest）2、Newcombe的涂布试验3、Lederberg等的影印平板培养法(replicaplating)(五)基因突变及机制1、诱发突变（inducedmutation）

诱发突变简称诱变，是指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段。凡具有诱变效应的任何因素，都称诱变剂（mutagen）。1）碱基的置换（substitution）转换(嘌呤间或嘧啶间)颠换(嘌呤和嘧啶间)

亚硝酸引起的使A︰T转换成G┇C

过程的简式见下图

HNO2

A:THe:THk+T第一次复制A┇THk┇C第二次复制

G┇C

Hk┇C①直接引起置换的诱变剂

②间接引起置换的诱变剂

2）移码突变（frame-shiftmutation）

指诱变剂会使DNA序列中的一个或少数几个核苷酸发生增添（插入）或缺失，从而使该处后面的全部遗传密码的阅读框架发生改变，并进一步引起转录和转译错误的一类突变。诱变剂：ICR（美国一癌症研究所名称）类化合物：原黄素，吖啶黄，吖啶橙等。诱变机理：至今不清。结果：加3、减3；加（减）1，短距离减（加）1；影响小。增（减）1、2、4、5引起后面全变。常见的致变剂及其致变作用(a)亚硝基的脱氨作用；(b)烷化剂和被甲基化的碱基；(c)5-溴脱氧嘧啶与鸟嘌呤配对(A=T变G三C)。

3）染色体畸变（chromosomalaberration）

某些强烈理化因子会引起DNA分子的大损伤（macrolesion）染色体畸变。既包括染色体结构上的缺失（deletion）、重复(duplication)、插入(insertion)、易位(translocation)和倒位(inversion)，也包括染色体数目的变化。转座（因）子：在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA顺序。其跳跃过程往往导致DNA链的断裂或重接，产生重组交换、基因启动或关闭，使突变发生。转座（因）子主要有三类：IS、Tn、Mu。2、自发突变自发突变（spontaneousmutation）是指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变。自发突变的原因:1）背景辐射和环境因素的诱变；2）微生物自身有害代谢产物的诱变效应；3）互变异构效应；（配对错误）4）环出效应。（发生缺失）(六)紫外线对DNA的损伤及其修复嘧啶碱基受紫外辐射后产生的衍生物(六)紫外线对DNA的损伤及其修复

1、光复活作用（photoreactivation）把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下时，就可出现明显降低其死亡率的现象，此即光复活作用。

2、切除修复（excisionrepair）是活细胞内一种用于对被UV等诱变剂损伤后DNA的修复方式之一，又称暗修复（darkrepair），这是一种不依赖可见光，只通过酶切作用去除嘧啶二聚体，随后重新合成一段正常DNA链的核酸修复方式。一、化学诱变剂

碱基类似物二、物理诱变剂

非电离辐射类因子和电离辐射类因子两种三、生物诱变剂

（一）转座诱发突变（二）转化诱发突变（三）转导诱发突变（四）定点诱导第二节诱发突变及诱变剂第三节突变体的选择和检出一、基因的突变延迟原因：

突变前所产生的物质仍然在细胞中存在活性诱变剂作用在DNA的一条链上多核细胞，所有的核都变为变异的核时细胞才会表现出来二、突变体的筛选（一）随机筛选（二）根据菌落特征或生化反应筛选（三）冷敏感菌筛选法（四）梯度平板法（五）营养缺陷型菌株的筛选菌种筛选的策略筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求初筛：要力求快速、简便复筛：应该做到精确，测得的数据要能够反映将来的生产水平(1)从菌体形态变异分析——初筛有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。

平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的“形态”变化。纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等。——定性或半定量用，大大提高筛选的效率——初筛微生物特异性平板检测方法饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片变色圈指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，如待筛选菌具有该营养物的前体转化成营养物能力，工具菌就能围绕该菌生长待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质摇瓶培养法摇瓶培养法是将待测菌株的单菌落分别接种到三角瓶培养液中，振荡培养，然后，再对培养液进行分析测定。特殊变异菌的筛选方法营养缺陷型突变株抗阻遏和抗反馈突变型抗生素抗性突变株条件抗性突变营养缺陷型突变株浓缩、进一步检出和鉴别营养缺陷型等步骤。筛选步骤：浓缩营养缺陷型菌株常用的浓缩方法有抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。目的：淘汰大量野生型，使营养缺陷型占的比例增加进一步检出所需缺陷型逐个检出法影印培养法一般从菌落大小也可以判断，新长出的菌落较小，即是营养缺陷型夹层培养法营养缺陷型的鉴定获得的营养缺陷型菌株还应进一步确认其生长的所需物。生长谱法组合补充培养基法营养缺陷型的应用

利用营养缺陷型突变株来生产氨基酸和核苷酸是典型的例子天冬氨酸激酶(AK)被赖氨酸及苏氨酸协同反馈所抑制通过诱变处理，获得高丝氨酸缺陷型突变菌株，该突变型不能产生苏氨酸。在限量高丝氨酸的培养基中缺陷型菌株能够正常生长，并且因为消除了反馈抑制突变型能过量生产L-赖氨酸抗阻遏和抗反馈突变型抗阻遏和抗反馈突变型都是由于代谢失调所造成的，在细胞中已经有大量最终代谢产物时仍然继续不断地合成这一产物。选育结构类似物抗性突变株结构类似物是指一些和细菌体内氨基酸、嘌呤、维生素等代谢产物结构相类似的物质主要用于末端产物的积累抗性突变菌株的筛选抗生素抗性突变株在抗生素产生菌选育中，通过筛选抗生素抗性突变可提高抗生素产量。抗生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外，还能提高其它代谢产物的量。条件抗性突变因环境不同，能表现为"野生型"菌株的特性和突变型菌株特性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。温度敏感突变常用于提高代谢产物产量致死营养缺陷抗性突变菌株的筛选方法一次性筛选法一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。噬菌体抗性菌株耐高温菌株阶梯性筛选法梯度平板法纸片扩散法用打孔器将较厚的滤纸（如新华六号）打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放入涂布了菌悬液的平板上，一般9厘米的培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。组成酶变异株的筛选诱导酶的生产需要诱导物，而且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的影响。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）会引起酶合成的减少，诱导