第三章 细胞分离与胞内产物的溶解

第三章

微生物细胞破碎1生物分离过程的一般流程本章内容2常见的细胞壁结构细胞破碎技术包涵体的纯化方法本章的主要内容3概述微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数小分子代谢产物，以及细菌产生的碱性蛋白酶、霉菌产生的糖化酶、淀粉酶等等，称为胞外产物。但有些目的产物存在于细胞内部，如大多数的酶、蛋白、类脂等，称为胞内产物。自80年代以来，基因工程广泛应用，许多具有重要价值的生物产品应运而生，如胰岛素、白细胞介素、干扰素等。许多基因工程产物都是胞内产物，分离提取这些产物时，首先必须将细胞破碎，使产物释放，才能进一步提取分离。因此，破碎技术已引起了基因工程专家和生化工程专家的极大关注。4概述细胞破碎（cellrupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。53.1细胞壁结构对破碎的影响微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。6细菌细胞壁结构几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖组成，它是难溶性的聚糖链；相邻聚糖链上的短肽又交叉相联，构成了细胞壁的三维网状结构，包围在细胞周围；使细胞具有一定的形状和强度。7细菌细胞壁结构破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度。革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。

革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。药物名称宿主用途胰岛素大肠杆菌治疗糖尿病人生长激素大肠杆菌治疗侏儒病α-干扰素大肠杆菌治疗毛状细胞白血病等8

酵母细胞壁的结构示意图最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，上面的是一层糖蛋白，最外层是甘露聚糖，由1,6-磷酸二酯键连接成网状。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物。破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。9真菌的细胞壁真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成，少数含纤维素。与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。10红面包霉菌细胞壁具有同心圆层状结构主要存在三种聚合物最外层(a)是α-和β-葡聚糖的混合物，第2层(b)是糖蛋白的网状结构第3层(c)主要是蛋白质，最内层(d)主要是几丁质。红面包霉菌细胞壁的结构示意图11微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌霉菌壁厚20-80nm10-13nm100-300nm100-250nm层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白质葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白质(6-8%)脂类(8.5-13.5%)多聚糖(80-90%)脂类蛋白质细胞壁的组成和结构微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌真菌壁厚20-80nm10-13nm100-300nm100-250nm层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白质葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白质(6-8%)脂类(8.5-13.5%)多聚糖(80-90%)脂类蛋白质细胞壁的组成和结构12研磨3.2细胞破碎技术13机械破碎捣碎法研磨法匀浆法超声法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法化学破碎有机溶剂：表面活性剂：酸碱酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理14一、机械法机械破碎法又可分为高压匀浆破碎法（homogenization）高速珠研磨破碎法（beadgrinding）超声波破碎法（ultrasonication）15采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。1.高压匀浆法（High-pressurehomogenization）细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了高速剪切、碰撞及压力骤降，造成细胞破碎。1617高压匀浆器的种类高压匀浆器的种类较多：WAB公司的AVPGaulin31MR型Branandluebbe

公司SHL40型意大利Niro

Soavi高压匀浆机18高压匀浆法使用时注意事项高压匀浆器的操作温度上升约２-３℃/10MPa为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。19高压匀浆法适用的范围—大规模细胞破碎的常用方法☆高压匀浆法适用的范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎；料液细胞浓度可以很高，20%左右。☆不宜使用高压匀浆法。易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）20影响高压匀浆器细胞破碎因素被破碎的细胞分率符合如下公式：

ln[1/(1-R)]=KNPɑ(3-1)式中R—破碎率，为N次循环后，蛋白质的释放量Rn与最大释放量Rm之比；K－与温度有关的速度常数；P－操作压力，MPa；ɑ－与微生物种类有关的常数。21升高压力有利于破碎，减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。但p大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明p超生一定值时，R增加但很慢。在工业生产中，通常采用的压力为55－70Mpa。破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎。影响高压匀浆器细胞破碎因素22高压匀浆法-X-挤压器改进的高压方法：将浓缩的菌体悬液冷却至-25℃至-30℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋在冰中的细胞变形所引起的。主要用于实验室中。优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高对冷冻-融解敏感的生化物质不适用。232）珠磨法beadmill珠磨是常用的方法细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机WSK卧式高效全能珠磨机24高速珠磨机工作原理磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动；细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起在出口处，旋转园盘和出口平板之间的狭缝很小，可阻挡玻离小珠，使不被料液带出。由于操作过程中会产生热量，故磨室还装有冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和玻璃小珠。25NetzschLM-20型珠磨机A-具有冷却夹套的圆筒形磨室B-具有冷却装置的搅拌轴和圆盘C-环形震动侠缝分离器D-变速马达1和2料液进出口3和4搅拌冷却剂进出口5和6磨室冷却剂进出口园盘以两种位置交错地安装在轴上，一种处于径向，一种与轴倾斜，径向盘使磨料沿径向运动，倾斜盘则产生轴向运动。由于交错的运动，提高了破碎效率。26珠磨机破碎作用方程破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合下列公式：

ln[1/(1-R)]=Kt3-2

R—破碎率；K-一级反应速度常数；t-时间。K与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、玻璃小珠装量和珠体直径以及温度等相关。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。273）超声波破碎超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。28超声波破碎的机理JY92-IID超声波细胞粉碎机一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation),液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。29超声波破碎的适用范围超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。超声波破碎的有效能量利用率极低由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实验室小规模细胞破碎中常用。30

超声波破碎的效率与声能、声频、处理时间、细胞浓度及菌种类型有关。(1)振幅：振幅直接与声能有关，影响蛋白质释放的比速度k。(2)细胞悬浮液的黏度：黏度影响能耗并会抑制空穴现象。(3)表面张力：添加表面活性剂或从细胞中释放出表面活性物质(如蛋白质)，能显著地影响声波破碎效率。因为强烈起泡在气-液界面上会促使蛋白质变性和空穴清除，特别是应用高的功率时。(4)被处理悬浮液的体积：大体积需要高的声能引起强烈的涡流和大的气泡形成。(5)探头的形状和材料。31超声波破碎是细胞破碎中的一种普通方法，在许多实验室研究或生化物质的分离制备中都能见到，但是要向大量细胞悬浮液中通入足够的能量是很因难的，故在工业范围中还未采用这种破碎方法。一般来讲杆菌比球菌易破碎，革兰氏阴性菌较阳性菌易破碎，对酵母菌的效果较差。32技术原理效果成本举例匀浆法(孔型)须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎剧烈适中细胞悬浮液大规模处理珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠捣碎剧烈便宜细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理超声波法用超声波的空穴作用使细胞破碎适中昂贵细胞悬浮液小规模处理研磨法细胞被研磨物磨碎适中便宜匀浆法(片型)细胞被搅拌器劈碎适中适中动物组织及动物细胞不同机械破碎方法的比较33二非机械法酶溶破碎法（enzymelysis）化学破碎法（chemicaltreatment）去垢剂破碎法（detergents）渗透压冲击破碎法（osmoticshock）冻融破碎法（freezingandthawing）其中酶法和化学法溶胞应用最广。341酶解（酶溶法Enymaticlysis)酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等35外加酶法酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的β-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶，酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。36外加酶法有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。37酶解法的特点优点：发生酶解的条件温和能选择性地释放产物胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶)产物抑制的存在。

38酶解-自溶作用

自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。自溶作用：改变其生长环境（温度、ｐＨ、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。39某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。2化学渗透法（Chemicalpermeation）该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。40酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/LHCl。碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。成本低，反应激烈，不具选择性。（1）酸、碱处理法41细胞破碎常用的表面活性剂：十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；非离子型如TritonX-100和吐温（Tween）等。对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。（2）表面活性剂无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解42能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等（3）有机溶剂（4）EDTA螯合剂处理G-细菌，对细胞壁外层有破坏作用。G-细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。43通用性差；时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%；有些化学试剂有毒。化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度化学渗透法特点：缺点对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。优点443物理法渗透压冲击法冻结-融化法干燥法451）渗透压冲击法渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。462）冻结-融化法

将细胞放在低温下冷冻（约-15℃），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。47使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。冷冻干燥适用于不稳定的生化物质3）干燥法气流干燥真空干燥喷雾干燥冷冻干燥4849选择破碎方法的依据：细胞处理量；细胞壁强度和结构(高聚物交联程度、种类和壁厚度)；目标产物对破碎条件的敏感性；破碎程度；目标产物的选择性释放50选择性释放目标产物的一般原则⑴仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和的方法，如酶溶法、渗透压冲击法和冻结－融化法等。当目标产物存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法．当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节溶液PH值，离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易溶解释放。(2)机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。51讨论题：青霉素酰化酶细胞破碎的研究

一.化学法

20%(W/V)大肠杆菌悬浮液+B.A37℃搅拌高速离心测上清液酶活。1.处理时间

R%

2.5h2.丁酯用量条件：37℃，搅拌3小时适宜的B.A加量为12%，释放率R=55%12%55%R12%2.03U/mg比活52二.化学法—冻融法结合

加B.A(12%,37℃搅拌3h）菌悬液冻融(冻结14h融化)

释放率—70%；比活—2.69u/mg

三.化学—超声波振荡法结合

先丁酯处理，再超声波（90秒），释放率72%小型设备，不能工业大规模生产。四.高压匀浆法

20%(W/V)菌悬液，ΔP=50MPa，N=3。释放率R=38.4%，原因:细胞破碎后,仍有较多酶吸附在细胞碎片上。五.高压匀浆—化学法结合

先高压匀浆，再加10%丁酯，37