白花蛇舌草提取物对bel722细胞抗肿瘤作用机制研究

白花蛇舌草提取物对bel722细胞抗肿瘤作用机制研究

1材料和方法1.1材料表面1双蒸法制备法中药白花蛇舌草（olen）从中药房购买生药，将中药白花蛇舌草高速粉碎成粉末，浸泡在70蒸馏水中，滚18h，过滤上清液，在0.0850.095pma、60c温度下蒸发，得到浸泡石膏，然后通过100米的真空，在40c下冷却、干燥并成褐色粉末。将粉末溶于新鲜的双蒸水中,之后用0.22μm孔径滤膜过滤除菌,-20℃避光保存,使用时用无血清培养基稀释到所需剂量,4℃保存.22细胞系统细胞株Bel-7402来自中国医学科学院药物研究所.3药物、药物和药物RPMI1640、胰蛋白酶、conA(刀豆蛋白)为Gibco,USA产品;噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、Hepes均为Sigma公司,USA产品;小牛血清购自北京鼎国生物公司;长春新碱(VCR)购自扬州奥赛药业有限公司;维拉帕米(VRP)购自上海禾丰制药有限公司;青霉素(100万U)、链霉素(160万U)为东北制药厂产品.4老鼠昆明鼠.1.2方法1.2.1生活质量改善的对照组参照Alley的MTT法,以5000个/孔细胞的量接种于96孔细胞培养板中,每孔体积200μL,37℃5%?CO2培养24h.待细胞贴壁后,将细胞分为实验组和对照组.实验组Ⅰ只加不同浓度的中药制剂;实验组Ⅱ同时加入不同浓度中药制剂和终浓度为0.02mg/L的VCR.对照组Ⅰ为不加细胞的空白对照组;对照组Ⅱ为不加任何药物的阴性对照;对照组Ⅲ为抗癌药对照,只加终浓度为0.02mg/L的VCR;对照组Ⅳ为逆转剂阳性对照,同时加入终浓度为5mg/L的VRP和0.02mg/L的VCR.对照组及实验组每一剂量重复孔数为3孔.加样后,在37℃5%?CO2及饱和湿度条件下,培养72h,每孔再加入MTT溶液(5g/L)20μL,4h后终止培养,吸弃MTT,每孔加入DMSO150μL,在微量震荡器上震荡10min,使结晶物充分溶解,490nm比色,酶标仪自动打印记录结果.1.2.2细胞培养板tt-pcr脾淋巴细胞制备:无菌条件下取脾,并以180目细胞筛用注射器芯研磨,用RPMI1640冲洗,离心,计数,制成2×106/mL悬液(含10%FBS).加板(96孔板):细胞悬液200μL/孔;24h后加ConA10g/L,0.1μL/孔+药OLEN;37℃5%?CO2培养72h后,每孔加MTT溶液(5g/L)20μL;37℃5%?CO2培养4h后,将细胞培养板离心1500r/min,10min;之后弃上清,再加DMSO150μL/孔,在微量震荡器上振板10min,490nm比色,酶标仪自动打印记录结果.1.2.3细胞形成率检测收集处于对数生长期的细胞,接种细胞于25mL培养瓶中,每瓶1000个细胞,37℃5%?CO2培养.待细胞贴壁后,再加入药物.37℃5%?CO2继续培养4d后,于倒置显微镜下观察集落形成情况.计数集落数,多于50个细胞者记为集落,按下式计算集落形成率,集落形成率(%)=克隆数/接种细胞数×100%.1.2.4半薄切片观察取对数生长的Bel-7402细胞,用0.25%胰酶消化后离心900r/min,7min,用含FBS的RPMI1640培养液配制成单细胞悬液,接种于50mL的培养瓶内,使其终浓度为5×104/mL.24h后加药,并设空白对照组,继续培养56h后,将细胞离心1500r/min,10min,成团后,取沉淀细胞团,经2.5%戊二醛前固定,1%锇酸后固定,乙醇系列脱水,Epon812环氧树脂包埋,LKB-Ⅲ型超薄切片机半薄切片定位后做超薄切片,醋酸双铀及柠檬酸铅双重染色,JEM-1200EX型透射电子显微镜观察、对比观察其超微结构的变化,并摄片.1.3统计处理所有数据均采用t检验.2结果2.1白花蛇舌草提取物对大、小鼠bel-712细胞内表达的抑制率白花蛇舌草提取物作用Bel-7402细胞72h后,细胞生长受到抑制,而且抑制作用呈浓度依赖关系.见图1.从图1可以看出,白花蛇舌草提取物对多药耐药细胞Bel-7402作用72h后的抑制曲线,这条曲线呈对数曲线,随着白花蛇舌草提取物浓度的增大,对Bel-7402细胞的抑制率逐渐增加.从曲线中可得出IC50为1.6g/L.2.2bel-712细胞后4d集落形成率白花蛇舌草提取物作用Bel-7402细胞后抑制细胞集落形成,其抑制作用与白花蛇舌草提取物浓度呈正相关,200,300,400mg/L的白花蛇舌草提取物作用Bel-7402细胞后4d集落形成率分别为33.1%,23.1%,21.3%,对照组为40.7%.对照组集落形状规整,集落细胞数多,细胞间排列紧密,细胞形态呈角形,边缘模糊;加白花蛇舌草提取物组,集落形状不规整,集落细胞数变少,细胞间排列变松散,细胞贴壁不好,细胞形态出现变化,见图2,3.图2中可见集落形状规整,集落细胞个数多,细胞间排列紧密,细胞形态呈角形,边缘模糊、规则.图3中可见集落细胞间排列变得松散,细胞贴壁不好,细胞形态出现变化.2.3肿瘤核酸组织电镜下观察:在放大2500倍下,未加药对照组,可见多个瘤细胞,细胞呈圆形或多角形,细胞表面有许多微绒毛,核呈不规则形,有切迹,核仁明显,有多个核仁,肿瘤细胞内可见微丝,见图4A;加药组细胞可见多个瘤细胞,细胞体积变小,细胞肿胀、出现空化现象,核轻度固缩,见图4B.在放大10000倍下,未加药对照组的肿瘤细胞核膜清晰,核仁明显,胞质内可见较多的核糖体以及线粒体和粗面内质网,细胞内可见微丝,见图5A;加药组的肿瘤细胞呈椭圆形,表面微绒毛减少,核呈固缩状,异染色质凝聚,胞质内可见较多的溶酶体,线粒体肿胀,见图5B.在放大7500倍时,可见细胞膜破损,并且有细胞内容物外溢,胞质空化,线粒体变大变圆,基质变淡,线粒体嵴变短变少甚至消失,在极度肿胀时转化为小空泡状结构,核内异染色质浓聚,见图6.图4A为未加药对照组的Bel-7402细胞的形态,箭头所示核呈不规则形,有切迹.图4B为加药组的Bel-7402细胞的形态,箭头所示核轻度固缩.图5A为未加药对照组的Bel-7402细胞的形态,箭头所示胞质内可见较多的线粒体,图5B为加药组的Bel-7402细胞的形态,箭头所示胞质内可见较多的溶酶体.图6中可见细胞膜破损,并且有细胞内容物外溢,箭头所示线粒体嵴变短变少甚至消失,在极度肿胀时转化为小空泡状结构.2.4白花蛇舌草提取物对小鼠脾t细胞的影响表1中的P值是进行t检验,每一浓度+conA组都分别与conA组进行比较.从表2可以看出:白花蛇舌草从终浓度为200mg/L时,P<0.05,有统计学意义,而且每一浓度+conA组的平均值都大于conA组的平均值,可以认为白花蛇舌草提取物从终浓度200mg/L时就使T淋巴细胞增多.所以,我们可以得出体外实验时白花蛇舌草提取物的安全剂量范围在100～1000mg/L浓度期间.白花蛇舌草提取物的终浓度在100～1000mg/L期间,能促进小鼠脾T淋巴细胞增殖,可见白花蛇舌草提取物对正常细胞几乎无毒性作用.3白花蛇舌草提取物对大鼠肿瘤细胞形成的影响从中药中筛选抗肿瘤药物是目前肿瘤药物治疗研究的一个热点,近年来,研究中草药及其有效成分对肿瘤细胞的抑制作用方面已有许多报告,但对多药耐药肿瘤细胞的抑制作用方面还很少.白花蛇舌草是我国传统中药,它不仅有抗菌作用,对单核巨噬细胞系统吞噬功能等有影响,增强肾上腺皮质功能作用,而且还有抗肿瘤作用.肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,治疗方法包括手术、化疗等多种方法.随着抗肿瘤药的研究及开发步入崭新的阶段,相伴而来的耐药性的产生成为治愈癌症的重大障碍.文章报告了白花蛇舌草这一传统中药对人多药耐药肿瘤细胞Bel-7402的抗肿瘤活性研究.白花蛇舌草提取物对人肝癌多药耐药细胞Bel-7402有抑制作用,并且与浓度呈正相关关系,IC50为1.6g/L,通过透射电镜观察可以看到,白花蛇舌草提取物对Bel-7402细胞可能是直接影响能量代谢而发挥直接杀伤作用的.MTT可在线粒体内琥珀酸脱氢酶的作用下发生断裂,形成蓝色沉淀物甲瓒,其形成量与活细胞内琥珀酸脱氢酶的活性及活细胞的量密切相关,故可用以反映细胞的代谢情况.肿瘤细胞集落形成能力是其重要的恶性特征之一,与肿瘤的发生、发展、转移能力有关,是体外筛选抗肿瘤药物的重要方法.肿瘤细胞原本是代谢极为旺盛的细胞,形态上呈现出细胞表面有许多微绒毛,细胞核内染色质大而淡,胞浆内核糖体大量增生、线粒体较多等特征,这些特征有利于肿瘤细胞的快速增殖,可形成较多的集落.本实验结果表明,白花蛇舌草提取物可能直接影响Bel-7402肿瘤细胞的能量代谢,电镜下清晰可见白花蛇舌草提取物作用后的肿瘤细胞膜破损,并且有细胞内容物外溢;多数细胞表面微绒毛减少、变短甚至消失;细胞核体积变小,核染色质聚集成团状,说明肿瘤细胞代谢不活跃,细胞活性降低,甚至细胞受损;粗面内质网的池扩张,粗面内质网互相离散,膜上的颗粒呈不同程度的脱失,重度扩张时则形成大而不规则的空泡;线粒体是细胞内主要的能量形式所在,是对损伤最敏感的细胞器,在白花蛇舌草提取物作用下发生肿胀,线粒体变大变圆,基质变淡,嵴变短变少甚至消失,在极度肿胀时,线粒体可转化为小空泡状结构;白花蛇舌草提取物作用后的肿瘤细胞内出现多量的脂褐素,这提示受到药物作用后肿瘤细胞代谢减慢,细胞功能减退.上述形态学改变损伤或破坏了肿瘤细胞线粒体和核的正常结构,从而影响了细胞的正常功能,使之增殖速度减慢,在细胞行为上表现为DNA的复制受到抑制,细胞的活力受到不同程度的损伤,达到有效抑制Bel-7402细胞分裂的作用,出现MTT?A490值显著少于对照组,形成的细胞集落数明显减少,从而证明白花蛇舌草提取物具有抑制人肝癌多药耐药细胞Bel-7402体外生长的作用,并从细胞代谢和形态学变化的角度初步论证了白花蛇舌草提取物的抑瘤机制.淋巴细胞转化实验表明,白花蛇