骨性关节炎兔骨内固定治疗过程中关节软骨的动态改变

骨性关节炎兔骨内固定治疗过程中关节软骨的动态改变

骨关节炎（oa）是一种常见的关节疾病，严重危害老年人的健康。随着年龄的增长，发病率呈显著上升，但其发病机制尚不清楚。建立骨关节动物模型对病因、病理和治疗的研究是非常重要的。目前,已有许多关于骨性关节炎动物实验模型的研究,但大部分仅针对骨关节炎形成后骨关节某一方面的改变进行探讨,如光镜下软骨组织形态学改变、关节液中细胞因子如白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和/或肿瘤坏死因子α(Tumornecrosisfactorα,TNF-α)含量变化等。很少有研究涉及关节软骨组织形态学和细胞因子(IL-1β和TNF-α)的连续动态变化,有关采用电镜对骨关节炎发生过程中软骨形态变化的研究更少。本研究通过切断兔膝关节内侧副韧带和内侧半月板制备骨性关节炎动物模型,分别采用光镜和扫描电镜连续动态观察其关节软骨组织学变化,并在骨性关节炎发生过程中的不同时间点检测关节液中IL-1β和TNF-α含量的变化,旨在对骨关节炎模型的发生发展作一相对全面的研究,深入探讨骨性关节炎发生发展的过程和发病机制。1材料和方法1.1试验组和手术方法15只成年新西兰大白兔(30个膝关节),体重为2.5kg~3kg,由北京大学医学部动物部提供。动物随机分为实验组(12只,24个膝关节)和对照组(3只,6个膝关节)两组。实验组均在两侧关节施行手术。经耳缘静脉注射20%乌拉坦(5ml/kg)全身麻醉,无菌条件下行膝内侧髌骨旁切口,仔细解剖内侧副韧带,切断并切除内侧副韧带长约0.5cm;打开关节腔,切除内侧半月板,缝合关节腔及皮肤。术后每只兔肌注40万单位青霉素,连续3天,以防膝关节感染。3只正常兔作为对照组。1.2对照组治疗方法实验组动物分别于术后1周、2周、3周、4周取材,实验组每次取材3只(6个膝关节),对照组在第4周取材3只(6个膝关节)。麻醉后从髌上囊部位注射入关节腔1ml无菌PBS,反复活动关节后,仔细抽取灌洗液,做好标记后立即置于-70℃冰箱中保存备用,然后采用空气栓塞处死动物,切开关节腔,将游离的关节和关节囊固定于中性多聚甲醛固定液中。1.3观察指标1.3.1软骨表面的石墨分类标本于10%多聚甲醛中固定3天后,流水冲洗12小时。内外股骨髁软骨面用蒸馏水洗净后,用滤纸轻轻擦干,用毛笔将墨汁刷于软骨表面,半分钟后,用蒸馏水将墨汁冲去,将上述过程再重复一遍。根据Yoshioka等的分类标准将软骨表面的大体所见分为4级:Ⅰ级:软骨面完整,无墨汁沉积;Ⅱ级:软骨表面轻度纤维化,墨汁染色可见长条形的斑点样沉积或淡灰色斑痕;Ⅲ级:软骨表面明显纤维化,墨汁染色可见深黑色斑痕,呈天鹅绒状;Ⅳ级:软骨表面糜烂,墨汁染色见软骨缺失,暴露软骨下骨。1.3.2木本糖组hematoxyin&在精神质量和甲苯胺蓝染色关节软骨经过固定后,常规脱钙、冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋和切片,苏木素-伊红(HematoxylinandEosin,HE)和甲苯胺蓝染色。1.3.3扫描电镜观察标本取材后,经戊二醛固定,蔗糖冲洗及锇酸处理后,进行临界点干燥,喷金镀膜,完成电镜标本制作,在扫描电镜(日本电子公司,型号JSM-5600LV)下观察标本。1.3.4elisa试验采用酶联免疫吸附(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)方法。分别取每份关节腔灌洗液100μl进行IL-1β和TNF-α蛋白表达分析。应用美国Biosource公司提供的ELISA试剂盒,根据说明书具体操作。1.4染色结果的统计学处理所有数据均用SPSS11.5进行统计分析。关节软骨墨汁染色结果用Kruskal-Wallis秩和检验,ELISA结果用t检验,P<0.05为有统计学意义。2结果2.1各级别单位的检测结果表1显示,对照组股骨内髁Ⅰ级5例,Ⅱ级1例。实验组1周股骨内髁Ⅱ级4例,Ⅲ级2例;2周Ⅱ级1例,Ⅲ级4例,Ⅳ级1例;3周Ⅲ级4例,Ⅳ级2例;4周Ⅲ级3例,Ⅳ级3例。采用Kruskal-Wallis秩和方法检验各实验组与对照组之间均有显著性差异(P<0.05)。2.2软骨组织结构失稳对照组:HE染色示正常软骨基质呈淡粉色,着色均匀,软骨细胞核呈蓝色。软骨细胞排列有序,从上至下依次为表层、中间层、柱状层和软骨下骨层(图1A);甲苯胺蓝染色均匀,无基质失染(图1B);扫描电镜示软骨表面呈垄沟样排列,排列有序,软骨表面无血管及细胞分布,胶原纤维不裸露(图1C)。实验组1周:HE染色示细胞排列开始出现紊乱,软骨内细胞密度不均一,有细胞簇聚现象(图1D);甲苯胺蓝染色部分失染(图1E);扫描电镜示关节软骨表面垄沟样结构可见,垄部低平,沟部变浅,无软骨细胞及胶原纤维裸露(图1F)。实验组2周:HE染色示软骨表层不平整,细胞排列进一步紊乱,细胞簇聚(图1G);甲苯胺蓝染色软骨层失染(图1H);扫描电镜示关节软骨表面垄沟样结构消失,软骨表面出现小裂(图1I)。实验组3周:HE染色示软骨表层缺失,软骨层变薄,表面纤维化(图1J);甲苯胺蓝染色软骨层失染(图1K);扫描电镜示软骨表面胶原纤维裸露、断裂(图1L)。实验组4周:HE染色示软骨表层缺失严重,软骨层进一步变薄,软骨细胞大量减少,细胞大量簇聚(图1M);甲苯胺蓝染色软骨全层失染(图1N);扫描电镜示软骨细胞裸露,表面出现空的陷窝(图1O)。2.3il-1在术后2周和4周时疗效造模手术后,关节液中炎性因子IL-1β和TNF-α表达明显升高。IL-1β在术后2周时达峰值,此后逐渐下降,到4周仍处于较高水平。TNF-α在1周时明显升高,2周时有所下降,3周时又升高,4周时下降,但仍处于较高水平(表2)。3小鼠骨髓结构变化骨性关节炎又称退行性骨关节病,是一种累及关节软骨、软骨下骨、关节滑膜等多种组织的疾病,而关节软骨的退行性改变是该病中主要病变的部位,通过建立骨关节炎的动物模型进行实验研究是对其发病机理、预防及治疗研究的必要手段。近年来制备OA动物模型的方法有以下几种。Okazaki等用石膏将兔的膝关节固定于伸直位5~6周可获得OA模型。但有人发现此方法动物痛苦大,模型程序较难标准控制,获得的OA模型效果不甚满意。Marijnissen等在犬的膝关节股骨髁负重区关节软骨处锐器划痕,但不伤及软骨下骨,10周后发现损伤软骨周围有软骨细胞聚集,蛋白多糖中度丢失,软骨细胞间质丢失,软骨表面胶原纤维变性,深层软骨细胞成簇排列,常伴有异染色质减少等病理性改变,所有这些改变都与OA特征相符合。但这一模型难以标准化,未得到广泛认可。Kikuchi等将胶原酶注入兔膝关节腔内,发现出现了典型的关节软骨退行性变,并随时间的推移而逐渐加重,且与剂量呈正相关。本实验采用切断并切除内侧副韧带0.5cm合并切除内侧半月板成功建立了OA兔的模型,研究发现该制模方法手术创伤小,软骨病变部位重复性好,建模时间短,模型稳定,能较好地反映OA软骨退变的全过程,便于对OA软骨作系统研究。关节软骨的退行性改变及破坏是OA的基本病变。最早期的病理变化发生于关节软骨表面的胶原纤维退化,使软骨超负荷面变薄,可见龟裂、粗糙不平,随着胶原纤维化的进一步发展,胶原退化在关节损害的边缘和临近的细胞间质更加明显。本实验结果发现实验组1周:HE染色可见细胞排列开始出现紊乱,软骨内细胞密度不均一,有细胞簇聚现象;甲苯胺蓝染色部分失染;扫描电镜可见关节软骨表面垄沟样结构,垄部低平,沟部变浅,无软骨细胞及胶原纤维裸露。这可能是由于蛋白多糖丢失造成的,而此时的胶原纤维网架结构尚未被破坏。实验组2周:HE染色示软骨表层不平整,细胞排列进一步紊乱,细胞簇聚;甲苯胺蓝染色软骨层失染;扫描电镜示关节软骨表面垄沟样结构消失,软骨表面出现小裂。这表明软骨细胞可能开始失代偿,失代偿的软骨细胞和代偿软骨细胞共同存在。软骨细胞代谢及反应性增殖,形成细胞簇聚现象,都可能是软骨代偿的表现。电镜显示表面出现小裂可能是失代偿的表现。随着OA的进一步发展,软骨的深层发生裂隙,关节软骨失去其原来的蓝白色和光滑的色泽而变成暗黄和颗粒状。软骨面的缺损程度在病变不同时期各异。磨损最大的关节面上的软骨被擦去,使软骨下骨显露。由于不断摩擦,骨面变得很光滑,呈象牙样骨,磨损较小的外围软骨面出现增殖和肥厚。由于中央部位软骨的消失和外围软骨的增生,改变了关节面上生物应力的分布和幅度,使关节面不同部位承受不同的应力,至关节软骨全层消失,露出骨质。实验组3周:HE染色示软骨表层缺失,软骨层变薄,表面纤维化;甲苯胺蓝染色软骨层失染;扫描电镜显示软骨表面胶原纤维裸露、断裂。随着骨关节炎的发展,软骨损伤逐渐加重,代偿的软骨细胞逐渐减少,失代偿的软骨细胞逐渐增多。软骨细胞变性坏死、胶原纤维断裂暴露均是失代偿的表现。实验组4周:HE染色示软骨表层缺失严重,软骨层进一步变薄,软骨细胞大量减少,细胞大量簇聚;甲苯胺蓝染色软骨全层失染;扫描电镜软骨细胞裸露,表面出现空的陷窝。软骨进一步被破坏,表层已经缺失,完整的网架结构己被破坏,软骨细胞大量减少,细胞大量簇聚已表明此时的软骨处于失代偿状态。近年来的研究表明,细胞因子和生长因子在骨性关节炎发生发展的病理生理过程中起着重要作用,它们与滑膜、关节软骨和软骨下骨的功能改变密切相关。一些因子在关节炎的病理过程中对关节软骨和关节滑膜具有一定的破坏作用,其中最引人注目的是IL-1β和TNF-α,这两种细胞因子是关节炎病理过程中促进软骨基质降解和关节软骨破坏的两种最重要的细胞因子。研究证实在OA患者的关节液中IL-1、TNF等细胞因子水平明显升高。IL-1可以诱导NF-kappB家族成员bcl-3基因抑制因子的表达,从而抑制bcl-3表达,促进软骨细胞凋亡。此外,IL-1可以促进软骨细胞和和滑模细胞合成基质金属蛋白酶(MMPs)和PGE,并且能抑制透明软骨特异性II、IX胶原和蛋白多糖的合成,和TNF有协同作用,TNF可促进PGE的产生,并且可诱导软骨细胞产生过氧化反应,与IL-1共同促进软骨吸收,从而介导了骨性关节炎软骨的破坏。Sandra在链球菌细胞壁诱导的关节炎研究中发现IL-1β在关节软骨的破坏和炎症细胞的浸润方面占有主要地位,而TNF-α在关节肿胀方面发挥作用;IL-1β和TNF-α在诱导过程中高表达,且TNF-α的高峰早于IL-1β的高峰出现;并认为在这种动物模型中IL-1β的表达不依赖于TNF-α的调节。本研究结果显示IL-1β在1周时已明显升高,2周时达峰值,3周时开始下降,4周时仍然维持在较高水平。TNF-α变化呈双峰态改变,1周和3周时是峰值,4周时仍然维持较高水平,提示这两种细胞因子可能在骨性关节炎发生的不同阶段具有不同的作用,而且它们表达的调控机制也有所不同,与Sandra等学者的研究结果相似。本实验亦发现IL-1β和TNF-α的表达水平未见随软骨损伤的进行性加重而不断升高。关节液中细胞因子的高表达可能与关节内组织的急性损伤和急性炎症反应有关,随着急性炎症期的结束,肉芽组织和基质蛋白形成,IL-1β和TNF-α的分泌有所下降,但仍然高表达。骨性关节炎的发病机制十分复杂,各种细胞因子和氧化剂参与其中,它们相互作用,形成一个复杂的网络,具体机制仍不十分清楚,有待于进一步的研究。在基因治疗的研究中,IL-1β和TN