版纳微型猪ghr基因克隆及表达谱分析

版纳微型猪ghr基因克隆及表达谱分析

动物的生长发育是一项高度复杂的生理过程，受到许多因素的影响，如神经、遗传、营养和环境。其中，动物营养促生素酶（gore-grace）中的因子和基因主要用于生长调节。分类1。GH-GHR-IGF-1作为生长轴上的中心环节,在动物的生长调控中起着非常重要的作用［2-4］。GHR能通过信号转导调节GH的促生长作用。细胞表面的GHR与GH结合后,发生二聚化,引起细胞内JAK2、IRS、蛋白激酶C等一系列蛋白质的磷酸化,通过信号级联放大激活下游相关蛋白,促进IGF-1的表达,调节细胞多种代谢活动［5-7］。GHR几乎遍布各组织,运用Northen印迹等一些较灵敏的方法在哺乳动物的肝脏、皮肤、肌肉、胃肠道、骨、肾、大脑、下丘脑、胚胎干细胞等都检测到了GH的结合位点。在垂体中也发现了GHRmRNA,说明它既是GH的分泌器官,又是GH的靶器官［8］。猪GHR基因位于16号染色体,编码区长1917bp,编码638个氨基酸。与人的GHR序列长度相同。人的GHR序列前18个氨基酸残基组成信号肽区,N端246个氨基酸为胞外域,是配体结合结构域,包含7个保守的半胱氨酸残基,起稳定GHR胞外域空间结构的作用;在胞外域靠近膜的位置Y/FGEFS样基序,预测可能是GH-GHR结合的关键要素［9-11］;第247~270为强疏水性氨基酸构成的跨膜区;271~638为胞内域,包含两个保守结构域BOX1和BOX2,主要负责下游信号转导。GH结合GHR引起GHR二聚化,通过胞内域激活JAK2-STAT信号通路介导细胞对GH的应答［12］。版纳微型猪近交系(Bannamini-piginbredline,BMI)是世界上第一个培育成功的大型哺乳类实验动物近交系,30余年来,在近交选育及心脏、动脉异种移植的解剖学及免疫学等的生物医学和分子水平的研究,已显示出它作为实验动物模型的优越性［13-17］,但其矮小性分子机制尚缺乏理论依据。随着人拉氏综合征、侏儒鼠、性连锁矮小鸡等动物矮小机制研究的深入,版纳微型猪近交系的矮小性分子机理的研究也就成了迫切需要解决的问题。本研究对BMIGHR基因的结构和表达做了部分研究,初步探讨与BMI生长发育的关系,为进一步阐明版纳微型猪近交系矮小性分子机制奠定基础。1材料和方法1.1保存5采集版纳微型猪近交系大脑、神经纤维、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、胰、卵巢、肌肉组织,液氮速冻后-80℃保存。RNAPlus、reversetranscriptaseM-MLV、recombi-nantRNaseinhibitor、胶回收试剂盒、pMD18-T载体、大肠杆菌DH5α感受态细胞、DL2000marker和质粒提取试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)。1.2方法1.2.1半定量pcr检测mrna表达量参照GenBank上猪GHRmRNA序列(登录号:NM214254)和18S基因序列(NR_046261),利用Primer5.0和Oligo6.0软件设计3对特异性引物(表1),分别扩增BMIGHR基因的完全编码序列、GHR和18S基因部分序列,其中引物GHR2和18S用于半定量PCR分析GHRmRNA在各组织中表达量差异。以上引物送生工生物工程(上海)有限公司合成。1.2.2rna质量检测参照RNAPlus的使用方法,从版纳微型猪近交系大脑、神经纤维、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、胰、卵巢、肌肉等组织中提取总RNA,经核酸蛋白测定仪检测总RNA的纯度和浓度,根据测定的浓度将RNA稀释成200ng/μL后,取5μL进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像仪拍照后,使用QuantityOne软件对电泳条带进行灰度扫描,检测RNA质量,若28S和18S条带的比值在1.5以上,表明总RNA质量合格。将检测合格的RNA样品反转录为cDNA,反转录体系(20μL):50μmol/Loligo(dT)181μL,总RNA1ng~5μg,10mmol/LdNTP1μL,加入灭菌蒸馏水至12μL,混合后65℃加热5min,迅速置于冰上冷却;短暂离心后加入:5×firstbuffer4μL,0.1mol/L的DTT2μL,recombinantRNasein-hibitor1μL,轻轻将各组分混合,37℃孵育2min;室温下加入1μLreversetranscriptaseM-MLV,轻轻地吹打混匀,37℃孵育50min,70℃加热15min以终止反应,产物置-20℃储存备用。1.2.3pcr反应pa-tvec-torcdh5的制备通法根据引物的Tm值和GC含量筛选出合适的扩增体系和程序,以BMI的肝脏cDNA为模板,用GHR1引物扩增GHR基因。GHR1PCR扩增体系:10×LAbufferП2.5μL,2.5mmol/L的dNTPmix2μL,5U/μL的TaqE0.25μL,10μmol/L的上、下游引物各0.5μL,25ng/μLcDNA模板1μL,ddH2O18.25μL,总体积25μL。运行程序:94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环;72℃后延伸10min,47℃终止反应。产物经胶回收纯化后连接入克隆载体pMD18-Tvec-tor,转化DH5α感受态细胞,涂布在平板上,倒置培养过夜,进行蓝白斑筛选,挑取白色阳性单菌落,接种于含4mLLB液体培养基(Amp+)的玻璃试管里,振荡培养过夜。以菌液为模板,进行PCR鉴定,将含目的基因的菌液提取质粒后,与胶回收后的PCR产物一起送测序公司测序。1.2.4生物信息分析：ghr序列1.2.5grt2和18s半定量pcr扩增以BMI大脑、神经纤维、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、胰、卵巢、肌肉等12个组织的cDNA为模板,以看家基因18S为内参进行半定量PCR扩增,检测GHRmRNA在各组织中的表达差异。以GHR2和18S为引物进行PCR扩增。GHR2和18S的PCR扩增程序和体系与GHR1的相同,其中扩增18S基因时,buffer换成10×PCRbuffer。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统拍照后,使用QuantityOne软件对电泳条带进行灰度扫描,分析GHRmRNA在不同组织中表达量的差异。2结果与分析2.1提取要求的纯度提取的各组织RNA的A260/A280范围均在1.8~2.1之间,符合总RNA提取要求的纯度。将RNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测,从图1可以看到3条带,从上到下依次为28S、18S和5S,使用Quan-tityOne软件对电泳条带进行灰度扫描发现28S和18S条带的比值均在1.5以上,表明总RNA无降解,可用于反转录。2.2菌液pcr鉴定结果GHR1引物扩增的特异性片段为1917bp,与预期片段大小一致(图2)。菌液PCR鉴定结果如图3所示,结果为阳性,证明菌液中均含有目的基因的重组质粒。测序结果与GenBank上猪GHR基因序列比较,确定克隆的序列为BMI的GHR基因序列。2.3水调保鲜jat5测序结果表明,获得BMIGHR的cDNA序列长1917bp,提交GenBank获得登录号:KC999114。扩增序列为GHR基因的完全编码区,编码638个氨基酸,包含50个强碱性氨基酸、89个强酸性氨基酸、207个疏水氨基酸和194个极性氨基酸,蛋白质分子量为71.1×103,等电点4.5。信号肽预测结果显示,前18个氨基酸残基组成信号肽区。跨膜结构预测结果显示,第265AA-287AA是跨膜结构域(图4)。图5是BMIGHR的核苷酸及氨基酸序列,已经标出GHR主要功能区域。GHR蛋白质保守结构域预测结果显示:BMIGHR含有3个主要功能区域(见图6),1个促红细胞生成素受体配体结合结构域(erythropoietinrecep-torligand-bindingdomain),可通过级联放大JAK2/STAT5信号通路,诱导红细胞的增殖和分化;1个FN3保守结构域,即Ш型纤连蛋白结构域,它是纤连蛋白内部重复结构的一种类型,在约2%的动物蛋白中都有FN3结构域,包括胞外和胞内蛋白质、跨膜细胞因子受体、酪氨酸磷酸酶受体和粘附因子等;还有1个生长激素结合蛋白结构域(GHBP),除啮齿动物外,其他动物的GHBP均由在细胞表面的GHR水解释放胞外结构域产生。预测的GHR蛋白质二级结构见图7,α螺旋占19.59%含125个氨基酸,延伸链结构占24.61%含157个氨基酸,β转角占8.78%含56个氨基酸,无规则卷曲占47.02%含300个氨基酸。GHR蛋白的三级结构［18-20］见图8,参考模型为人生长激素受体胞外结构域,同源性为84.6%。BMI(KC999114)、五指山猪(ABD77501)、巴马小型猪(ABK55612)和长白猪(CAA38301)的GHR氨基酸序列同源性分析结果显示,BMI与五指山猪、巴马小型猪的同源性均为99.8%,与长白猪的为99.4%。GHR编码区碱基序列及氨基酸序列比对结果(图9、图10)显示,BMI与其他猪的GHR共有10个碱基突变位点,其中4个为无义突变,6个错义突变。BMI的GHR序列与五指山猪的相比有1个错义突变,c.1801位的A>G,导致p.I601V氨基酸变异,五指山猪第601位为I(异亮氨酸),BMI为V(缬氨酸)。与巴马小型猪相比有1个无义突变c237Y>T和1个错义突变c.811R>A,导致pX271I,巴马小型猪在271位氨基酸为X(任意氨基酸),BMI为I(异亮氨酸)。与长白猪相比有3个无义突变(c.1248A>G,c.1287A>G和c.1827A>G)和4个错义突变(c.1143G>T、c.1225G>T、c.1666C>G和c.1739C>G)。分别导致4个氨基酸位点变异p.E381D、p.A409S、p.L556V和p.A580G,即长白猪在381位为E(谷氨酸)、409位为A(丙氨酸)、556位为L(亮氨酸)、580位是A(丙氨酸);BMI在381位为D(天冬氨酸)、409位为S(丝氨酸)、556位为V(缬氨酸)、580位为G(甘氨酸)。猪的GHR胞外域序列高度保守,无氨基酸变异,变异均发生在GHR的胞内域。2.4电泳检测结果半定量PCR分析GHRmRNA在各组织中表达水平,PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测,结果见图11,在目的条带位置145bp和1161bp处均有扩增产物。对电泳条带灰度扫描结果显示GHRmRNA在不同组织中都有表达,其中在肌肉中表达量最高,在小肠、心、肝、神经纤维、脾、卵巢中表达量较高,在肺、胃、大脑、胰和肾中的表达量较低。3gh与gh的结合本研究扩增了BMIGHR基因1917bp全长编码区序列,其编码638个氨基酸,包括前18个氨基酸残基组成的信号肽区、19~264位氨基酸残基组成的胞外域,265~287的跨膜结构域和288~638的胞内域。GH是调控动物生长发育的重要因子,它对动物组织的促生长作用主要通过结合到各靶细胞膜上的GHR实现,一分子GH与两分子GHR结合后使GHR同源二聚化,胞内域的信号转导结构结合并激活一种非受体型胞浆可溶性Tyr激酶Januskinase2(JAK2),使其磷酸化,随后JAK2和GHR一起向下游传递GH的信号［12］。GHR胞外域是GH的结合域,哺乳动物的胞外域被蛋白酶酶解后形成生长激素结合蛋白(GH-BP),GHBP释放到胞浆后与部分GH结合,维持血清中GH浓度的稳定,延长GH的半衰期［21-22］,GH-BP对GHR与GH的结合有竞争抑制作用。GHBP还参与调节GHR基因的转录及核内信号转导等［23］,有研究显示GHBP浓度与GHR基因转录呈双向关系,低浓度(50pM)时,GHR基因转录增加,高浓度(500pM)时,GHR基因表达减少［24］。Laron等［25］报道的人类GH不敏感综合征患者GHR变异位点多集中在胞外域,主要影响了GH-GHR的结合,本研究获得的BMIGHR胞外域碱基突变位点(图9)与人类患者的不同,且无氨基酸变异(图10),这可能预示GHR的碱基及氨基酸变异不影响与GH的结合。GHR与GH结合后,激活胞内的JAK2及一系列蛋白质的磷酸化,是GHR进行信号转导的必经过程,这个过程主要是GHR的胞内域参与的。胞内域有两个重要结构:近跨膜区的富含脯氨酸的BOX1和距BOX1有30个氨基酸的BOX2。BOX1及其脯氨酸是激活JAK2的必须结构［26-27］,BOX2参与GHR介导的细