柴胡皂苷a对难治性癫痫大鼠多药耐药蛋白p-糖蛋白表达的影响

柴胡皂苷a对难治性癫痫大鼠多药耐药蛋白p-糖蛋白表达的影响

癫痫是神经系统中常见的疾病。中国有600.700万患者，其中30%的患者出现癫痫发作，由于抗癫痫药物的抗癫痫药物或其他原因，通道转换变得困难。由于难治性癫痫发作频繁,严重影响患者的学习、工作和生活,甚至严重致残,因此研究难治性癫痫发病机制及寻找有效的治疗方法十分必要。柴胡为临床常用中药之一,具有镇静、止痛、降温、镇咳、抗炎抗菌、保肝利胆、降血压、抗病毒、抗肿瘤等作用,柴胡皂苷a(saikosaponina,SSa)为柴胡主要药理成分柴胡皂苷的一种单体成分,研究发现柴胡皂苷a具有抑制戊四氮致痫大鼠痫性发作的作用。此实验建立了氯化锂-匹鲁卡品难治性癫痫模型,以进一步探讨SSa的抗癫痫作用机制。1材料表面1.1动物雄性SPF级SD大鼠,体重180~220g,由南方医科大学实验动物中心提供,动物许可证号SCXK(粤)2006-0015。1.2托品注射液、丙戊酸钠合成制剂氯化锂(美国,Sigma公司,批号115K1308),盐酸匹鲁卡品(美国,Sigma公司,批号066k1730),硫酸阿托品注射液(郑州羚锐制药有限公司,批号0905052),丙戊酸钠片剂(VPA,杭州赛诺菲圣德拉保民生制药有限公司,批号0402049)。SSa(上海医药工业研究院),小鼠抗大鼠P-糖蛋白单克隆抗体(C219,Abcam公司,货号ab3364),羊抗小鼠IgG-HRP(武汉博士德生物工程有限公司)。柯达2000MM全光谱多功能活体成像系统(美国,Kodak公司)。2方法2.1癫痫持续时间用药实验大鼠癫痫性发作行为参照TurskiWA和王本国等人的方法,小剂量反复ip匹鲁卡品制备难治性癫痫大鼠模型。SD大鼠首先ip氯化锂(127mg·kg-1),18~24h后ip阿托品1mg·kg-1,30min后ip匹鲁卡品(10mg·kg-1)。如未出现癫痫持续状态(statusepilepticus,SE),则每隔30min继续ip匹鲁卡品(10mg·kg-1),直至大鼠出现癫痫持续状态后停止注射,空白对照组(A)大鼠ip等体积的生理盐水。大鼠癫痫持续状态发作持续>60min时,以10%的水合氯醛(300mg·kg-1)ip终止发作。痫性发作行为观察,参照Racine标准,0级:无发作反应;Ⅰ级:节律性口角、耳或面部肌肉抽动阵挛;Ⅱ级:点头并伴随更严重的面部肌肉抽动阵挛;Ⅲ级:出现前肢阵挛但不伴随直立;Ⅳ级:前肢阵挛伴随直立;Ⅴ级:全身强直阵挛发作而跌倒。Ⅳ级以上发作为成功的癫痫持续状态模型,未达到Ⅳ~Ⅴ级发作的弃用。2.2癫痫发作监测癫痫状态后的大鼠经过急性期24h后,进入10~15d左右的潜伏期,腹腔注射5%糖盐水5mL,2次/d。15d后进入4周慢性期,进行发作行为监测。按照以上标准,Ⅳ级以上发作为成功的癫痫自发发作模型。将成功的癫痫自发发作模型大鼠随机分为5组,模型组(B)、丙戊酸钠(VPA)组(C)、SSa低剂量组(D)、SSa中剂量组(E)、SSa高剂量组(F)。2.3给药时间A组和B组均等容积生理盐水ig给药,C组丙戊酸钠200mg·kg-1ig给药,D~F组ipSSa0.54,1.09,2.18mg·kg-1,各组均连续给药8周。2.4一般观察2.5抗kt-lt-hrp的制备治疗结束时,每组随机取3只大鼠,迅速麻醉后断头取脑,冰上分离海马、颞叶皮层,放入-80℃低温冰箱保存。蛋白裂解后,BCA法定量,制备SDS凝胶,加样电泳,待溴酚蓝电泳至分离底部时结束电泳。采用湿转法转膜,先将PVDF膜浸入含5%脱脂奶粉TBST封闭液中,置于水平摇床上,室温封闭1h后用TBST清洗3次,每次5min。用TBST配制一抗(小鼠抗大鼠P糖蛋白1∶25),将PVDF膜放入已配好的抗体稀释液中,4℃过夜,TBST清洗3次,每次10min。然后放入TBST配制HRP标记的二抗,(羊抗小鼠IgG1∶2000),室温1h。二抗孵育完后,TBST洗膜3次,每次10min。吸干多余的TBST,用BeyoECLplus发光液显影(A液与B液1∶1配制),KodakImageStation2000MM成像系统采集图像,用图像处理软件ImageTool3.0分析各蛋白带的灰度值,用P-gp/β-actin代表蛋白条带的灰度比值。2.6统计学分析数据用SPSS13.0软件进行统计学分析,计量资料用表示。不同用药组间比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD法。P<0.05有统计学意义。3结果3.1大鼠癫痫性发作情况在实验过程中,共对70只大鼠腹腔注射匹罗卡品制备难治性癫痫模型。其中5只大鼠反复给予匹罗卡品,始终无法诱发出SE,故弃用,其余65只大鼠在首次或追加匹罗卡品后开始出现痫性发作,并逐步达到SE。在急性期(24h)内,有9只大鼠因癫痫频繁发作而死亡;在潜伏期(2周)内,因频繁发作以及不能自主进食衰竭死亡共8只,多在SE后一周死亡;在慢性期,存活的大鼠均出现自发发作,发作级别从Ⅰ级逐渐发展至Ⅴ级,无致痫大鼠死亡。共有48只大鼠自发痫性发作达Ⅳ级或Ⅳ级以上为成功的难治性癫痫模型大鼠,根据随机数字表选取其中30只进一步实验。3.2统计学学处理用药前,各致痫组大鼠均表现Ⅳ级或Ⅴ级痫性发作,差异无统计学意义;治疗8周后,与模型组相比,VPA组及SSa低、中、高剂量组均可不同程度得减轻大鼠发作级别(P<0.05)。见表1。3.3ssa对海马区p-gp表达的影响如表2所示,在大鼠海马区,Westernblotting检测各组P-gp表达的灰度比值差异有统计学意义(P<0.001),给药后VPA增强P-gp的表达,SSa高剂量组可以降低海马区P-gp的表达,以高剂量组明显(P<0.01);在大鼠颞叶皮层,P-gp表达的灰度比值差异有统计学意义(P<0.001),给药后SSa低、中、高剂量均可以降低颞叶皮层P-gp蛋白的表达,以高剂量组明显(P<0.01)。4抗癫痫药物作用近年来,多药耐药在难治性癫痫中所扮演的角色逐渐被认识,其中P-gp与难治性癫痫的关系研究相对较为深入。研究发现难治性癫痫患者脑内特别是血脑屏障部位存在多药转运体和药物靶酶的高表达,参与了难治性癫痫的耐药,其中研究最多的是P-gp,P-gp参与了癫痫耐药的形成。在中枢神经系统,P-gp广泛存在于脑毛细血管内皮细胞、脑实质的星形胶质细胞的足突。其能在细胞和亚细胞水平调节药物在中枢神经系统的运输过程,在保持细胞内外底物的浓度梯度、阻止底物进入细胞起着重要的作用。当P-gp与底物在胞膜内侧结构结合时,依靠ATP的转化能量,P-gp像泵一样将达到或进入细胞内的药物或细胞毒性物质泵出,降低细胞内药物浓度,减轻细胞毒作用,从而产生多药耐药现象,以致影响疗效。癫痫发作后,P-gp在神经元、内皮细胞、大脑实质和血管周围的星形胶质细胞表达增加,这种增高是痫性发作诱导的。吕洋等用苯妥英钠、苯巴比妥钠、卡马西平和丙戊酸钠等抗癫痫药物作用于体外培养脑星形胶质细胞后发现P-gp表达增强,其变化与抗癫痫药物的剂量和时间有关,并随着剂量增加及时间的延长呈一定正相关。提示P-gp表达增强也可能与抗癫痫药物的诱导作用有关。Brandt等选择一组苯巴比妥的耐药鼠,同时联合使用苯巴比妥及选择性P-gp抑制剂,结果表明联合用药组极大的恢复了苯巴比妥的抗癫痫作用。目前P-gp表达上调的机制尚未清楚,研究发现癫痫组织内的蛋白激酶C表达也随之增高,考虑可能通过蛋白激酶C的信号传导通路作用于MDR1基因,使MDR1转录和翻译增加,上调P-gp的表达。匹鲁卡品所致癫痫持续状态SE后的慢性自发癫痫模型,是唯一与临床最常见的成人癫痫病,即颞叶癫痫特征相一致的动物模型,是目前国际上公认的理想的颞叶癫痫动物模型。难治性癫痫中约70%是颞叶癫痫,因此,匹鲁卡品所致SE后的慢性自发性癫痫模型,是研究难治性癫痫较理想的模型。本课题组前期临床研究表明,自拟方柴胡疏肝汤对癫痫发作有较好的临床防治效果;实验研究表明,柴胡疏肝汤能减轻难治性癫痫大鼠的癫痫发作和降低P-gp的表达,在此基础上逐步筛选出君药柴胡的有效成分SSa。课题组前期研究发现,SSa在抗最大电惊厥中起主要作用,并具有对抗小鼠戊四氮致痫作用,对小鼠强直性惊厥发生有较