m4受体激动剂毛果芸香碱对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

m4受体激动剂毛果芸香碱对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

心肌缺血时，交感神经系统激活，增加心肌收缩力，减少氧气消耗，加剧血氧供氧失衡。此时,若激动心肌M3受体,则可诱发一种延迟整流钾电流(IKM3),使心率减慢、心肌收缩力减弱,从而对抗交感神经过度兴奋,减少心肌耗氧量,对缺血心肌产生保护作用,故心肌M3受体成为抗心肌缺血性损伤药物作用的新靶点。M3受体激动剂毛果芸香碱(pilocarpine)能激活心肌M3受体、诱发IKM3,呈剂量依赖性调节心肌细胞电生理特性,即降低窦性节律、缩短动作电位时程、膜电位超极化,进而产生负性肌力和负性频率的调节作用。因而推测,毛果芸香碱可通过激动心肌M3受体对缺血心肌产生保护作用。本实验的目的是观察M3受体激动剂毛果芸香碱对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。1材料和方法1.1动物健康Wistar大鼠,280～320g,雌雄各半(哈尔滨医科大学实验动物中心)。1.2抗氧化酶sod毛果芸香碱(Sigma公司);4-diphenylacetoxy-N-methylpiperidine-methiodide(4-DAMP,加拿大蒙特利尔心脏研究所惠赠);丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所);红四氮唑(redtetrazoline,中国华东师范大学化工厂);肝素钠(heparin,中国上海第一生化药业公司制品厂);戊巴比妥钠(pentobarbital,中国上海试剂二厂)。1.3动玻璃匀浆机和温度高速离心浴锅Langendorff灌流装置(按参考文献搭建);DY89-1型电动玻璃匀浆机(宁波新芝科技股份有限公司);CS-15R低温高速离心机(Beckman公司);数控恒温浴锅(上海申胜生物技术有限公司);2100型&UV-2100型分光光度计[尤尼柯(上海)仪器有限公司]。1.4k-h液灌流组kh2大鼠以1%戊巴比妥钠(40mg·kg-1)腹腔麻醉,经舌下静脉肝素化(500u·kg-1),10min后固定在手术台上,打开胸腔后小心快速分离心脏,在主动脉距其起始部4～5mm处迅速将主动脉和其他血管一并剪断,立即置于盛有4℃冷K-H液的培养皿中,洗净残血,在液面下找出主动脉断端,迅速套入主动脉套管并固定。立即灌注通有95%O2和5%CO2混合气体的K-H液(mmol·L-1:NaCl118.5,KCl4.8,CaCl22.5,NaHCO325.0,KH2PO41.2,MgSO4·7H2O1.2,Glucose11.1,灌流液的pH为7.4)。剪去心脏周围附着的组织,并于肺动脉起始部与右室圆锥部之间剪一小口,使冠脉回流液流出,维持灌注液高度在75cm左右,灌流液温度保持在37℃。稳定灌流10min后,将全部心脏随机分为4组,每组8只,即①空白对照组(Normal组):正常K-H液连续灌流65min;②单纯缺血再灌组(IRI组):正常K-H液灌流10min,然后全心停灌25min,再灌30min;③毛果芸香碱组(pilocarpine组):用含有5μmol·L-1毛果芸香碱的K-H液灌流,余同②;④4-DAMP+毛果芸香碱组(4-DAMP+pilocarpine组):用含有3nmol·L-14-DAMP和5μmol·L-1毛果芸香碱的K-H液灌流,余同②。2观察指标2.1主动脉泄漏液体积测量分别将停灌前、复灌后1,5,10,15,20,25,30min等8个时间点的冠脉流出液用量筒收集并测量其体积,以mL·min-1表示。2.2心肌酶活性测定灌流结束后,立即剪下左室,用冰生理盐水制10%心肌匀浆,用于测定心肌MDA含量和SOD活性。MDA采用硫代巴比妥酸法测定,SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定。2.3心肌细胞的染色灌流结束后,立即剪下左室,每隔2mm将心肌横切成片,用滤纸吸去表面水份,放入1%红四氮唑磷酸缓冲液(pH7.4)37℃染色15min。梗死心肌细胞中的脱氢酶因细胞膜损伤而完全释放丢失,因而梗死心肌不被染色;正常心肌细胞含有脱氢酶,可被染为红色。剪下梗死心肌称取质量,以梗死心肌占左室质量的百分比表示梗死范围。2.4统计处理所有数据均以ˉx±s表示,组间采用t检验比较。采用SPSS10.0统计软件包进行统计学处理。3结果3.1专前控制和4-damp处理单纯缺血再灌组的冠脉流量随复灌时间的延长而显著下降,与空白对照组相比均有显著性差异(P<0.01)。毛果芸香碱可使缺血再灌注后的冠脉流量增加,其中5和10min的冠脉流量分别由单纯缺血再灌注组的(4.1±1.0)mL·min-1和(4.1±0.8)mL·min-增加到(5.7±1.2)mL·min-1(P<0.01)和(5.4±1.2)mL·min-1(P<0.05);而4-DAMP则使缺血再灌注后5和10min的冠脉流量减少,分别减至(4.4±0.9)mL·min-1(P<0.05)和(4.4±0.7)mL·min-1(P<0.05)。说明毛果芸香碱可改善心肌缺血再灌注后的冠脉流量,而4-DAMP可阻断其作用。见表1。3.2毛果芸香碱对心肌组织中mda的降血药单纯缺血再灌组的MDA含量由空白对照组的(10.1±3.9)μmol·g-1升高至(14.3±4.1)μmol·g-1(P<0.05);而SOD活性则由空白对照组的(191±55)U·mg-1下降至(128±36)U·mg-1(P<0.01),表明心肌缺血再灌注可产生大量氧自由基而引起心肌损伤。然而,毛果芸香碱可使心肌MDA含量降低,由单纯缺血再灌注组的(14.3±4.1)μmol·g-1降至(10.1±2.5)μmol·g-1(P<0.05);同时,提高心肌SOD活性,使其由单纯缺血再灌注组的(128±36)U·mg-1升高到(183±65)U·mg-1(P<0.05),说明毛果芸香碱可通过提高心肌SOD活性、降低其MDA含量,对氧自由基引起的心肌损伤起到保护作用。见表2。3.3毛果芸香碱可减轻心肌缺血再灌注所引起的心肌梗死毛果芸香碱降低心肌梗死面积,使其由单纯缺血再灌注组的(37.8±13.6)%降至(24.9±6.3)%(P<0.05),说明毛果芸香碱可减轻心肌缺血再灌注所引起的心肌梗死;而4-DAMP可阻断其作用,使心肌梗死范围由毛果芸香碱组的(24.9±6.3)%扩大到(35.8±9.6)%(P<0.05)。见表3。4相对保护作用本实验探讨了M3受体激动剂毛果芸香碱对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。结果表明,毛果芸香碱通过激动心肌M3受体可改善心肌缺血再灌注后的冠脉流量、降低心肌MDA含量并提高心肌SOD活性、缩小心肌梗死面积,进而减轻缺血再灌注时的心肌损伤,对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤产生保护作用。心肌缺血再灌注后,冠脉收缩导致低灌、冠脉流量减少等现象。因此,心肌缺血再灌后冠脉流量的变化可间接反映心肌损伤的程度。本实验结果显示,单纯缺血再灌注组的冠脉流量随复灌时间延长而显著下降。应用毛果芸香碱后,则冠脉流量明显增加;预先给予4-DAMP则毛果芸香碱的作用受抑。提示毛果芸香碱通过激动心肌M3受体来改善冠脉流量、纠正心肌缺血状态。当组织细胞缺血缺氧时,氧自由基清除系统功能降低或丧失,而氧自由基生成系统活性增强,氧自由基大量产生与急剧“堆积”,引起心肌组织严重损伤;该损伤程度可通过心肌MDA含量变化和SOD活性变化间接评定。本实验结果显示,心肌缺血25min再灌注30min后,心肌MDA含量升高而SOD活性降低。应用毛果芸香碱后,心肌MDA含量降低、SOD活性提高;预先给予4-DAMP则毛果芸香碱的作用受抑。提示毛果芸香碱通过激动心肌M3受体来抑制脂质过氧化过程、提高内源性抗氧化酶活性,减轻氧自由基对心肌的损伤。这与激动心肌M3受体对心肌缺血诱导的氧化应激有保护作用的研究相一致。心肌缺血缺氧过程中,心肌细胞既出现坏死,又发生凋亡。心肌细胞凋亡决定心肌梗死面积的大小,而后者又间接反映心肌损伤的程度。本实验结果显示,毛果芸香碱可缩小心肌缺血再灌注时心肌梗死的面积;该作用可被4-DAMP阻断。说明毛果芸香碱通过激动心肌M3受体来减轻心肌缺血再灌注损伤。这与激动心肌M3受体对心肌缺血诱导的心肌细胞凋亡有保护作用的研究是一致的。心肌缺血,细胞外Ca2+大量内流导致心肌细胞Ca2+超载,引起心肌细胞能量耗竭、细胞膜受损等反应,转而加重心肌缺血再灌注损伤。激动心肌M3受体可减轻氧化应激等诱导的心肌细胞Ca2+超载;另外,本课题组已证实,毛果芸香碱通过激动心肌细胞M3受体可抑制氯化钾