高效液相色谱法同时检测人血浆酮康唑和伏立康唑

高效液相色谱法同时检测人血浆酮康唑和伏立康唑

托吡唑和博尔康唑是临床上常用的抗真菌药物。酮康唑为咪唑类,伏立康唑是合成的三唑类药物;作用机制为抑制真菌细胞膜麦角甾醇的生物合成,影响细胞膜的通透性,抑制其生长。酮康唑用于治疗浅表和深部真菌病,如皮肤和指甲癣、阴道白念珠菌病、胃肠真菌感染等,以及由白念珠菌、类球孢子菌、组织胞浆菌等引起的全身感染。伏立康唑用于治疗侵入性曲霉病,以及对氟康唑耐药的严重侵入性念珠菌感染及由足放线病菌属和镰刀菌属引起的严重真菌感染。临床应用发现,伏立康唑的临床效应(疗效和不良反应)具有明显的浓度依赖性,有效治疗浓度范围为0.25～6.00mg·L-1,当血药浓度>6mg·L-1时,肝功能损伤的发生率明显增加。同时发现,给予相同的剂量,不同个体的血药浓度差异显著,即相同剂量下不同患者疗效和不良反应存在显著的个体差异。酮康唑的不良反应也较多,主要为肝损害和过敏性疾病。因此,伏立康唑和酮康唑的血药浓度监测具有重要的临床价值。关于血浆酮康唑和伏立康唑的检测已有报道,但同时检测这两种药物报道笔者较少见到。笔者在本试验中建立与评价同时检测人血浆酮康唑和伏立康唑的反相高效液相色谱法,旨在为临床检测提供依据。1药品、试剂与仪器甲醇和乙腈(色谱纯,天津市科密欧化学试剂开发中心),三氟乙酸(TFA,Sigma,064K3647);乙酸乙酯、正己烷、无水碳酸钠(分析纯,天津市化学试剂三厂);实验用水均为重蒸水(本实验室自制)。酮康唑标准品(湖北纽兰药业有限公司,纯度:99.5%,批号:040302),伏立康唑对照品(哈尔滨健迪医药科技开发有限公司,纯度:99.8%,批号:040401),卡马西平标准品(Sigma公司,批号:064K1653)。高效液相色谱仪为Agilent1100系列,包括G1322A在线脱气机,G1311A四元泵,G1313A自动进样器,G1316A温控箱,G1315B二极管阵列检测器,Agilent化学工作站[RevA.10.02.(1757)]。电子分析天平[AB204-A,梅特勒-托利多(上海)仪器公司];涡旋混合器(FZQ-2,江苏泰县医疗器械厂);氮吹仪(D10型,杭州蓝焰科技有限公司);重蒸水仪(1810-B型,江苏金坛市科析仪器有限公司)。1.3标准工作液和标准工作溶液的配制①准确称取酮康唑对照品25mg置于25mL量瓶中,用甲醇溶解定容至25mL,得质量浓度为1g·L-1的酮康唑标准储备液。用重蒸纯化水稀释成浓度依次为100,10,1mg·L-1的标准工作液(临用时稀释)。②准确称取伏立康唑对照品25mg置于25mL量瓶中,用甲醇溶解定容至25mL,得质量浓度为1g·L-1的伏立康唑标准储备液。用重蒸纯化水稀释成浓度依次为100,10,1mg·L-1的标准工作液(临用时稀释);③准确称取卡马西平标准品25mg置于25mL量瓶中,用甲醇溶解定容至25mL,最终质量浓度为1g·L-1。然后用甲醇稀释成浓度为10mg·L-1的内标溶液。准确吸取三氟乙酸1mL,用重蒸纯化水稀释并定容至1L。色谱柱:AgilentTC-C18(4.6mm×150mm,5μm,Agilent,USA);保护柱:TC-C18保护柱(4.6mm×12.5mm,5μm,Agilent,USA);流动相:乙腈-0.1%TFA-水=40:20:40(V/V/V);流速:0.9mL·min-1;柱温:40℃;检测波长:0～6.5min,294nm,6.5～9.0min,256nm。准确吸取待测血浆样品1.0mL置于10mL具塞试管中,加入10mg·L-1卡马西平内标工作液25μL,混匀后加入1mol·L-1氢氧化钠溶液500μL碱化血浆。再加入乙酸乙酯4.0mL、正己烷1.0mL,涡旋混匀2min。转移上层有机相于另一刻度离心管中,氮吹仪中吹干。用300μL流动相复溶,取复溶液于自动进样器样品瓶中,设定20μL进样检测。2保留时间和内标保留时间酮康唑和伏立康唑纯标、空白血浆、血浆标准等样品,经HPLC分析测定得到色谱图。酮康唑保留时间为3.8min,内标的保留时间为5.6min,伏立康唑的保留时间为7.8min。由图可见在本试验条件下,酮康唑、内标卡马西平和伏立康唑的色谱峰能完全分离,没有明显的内生杂质峰干扰。2.2回收率、精密度与定量下限取8只10mL具塞试管,依次加入不同浓度不同体积的酮康唑和伏立康唑标准工作溶液,再加入空白血浆1.0mL,配成酮康唑浓度相当于0.25,0.50,1.00,2.00,4.00,8.00,12.00,16.00mg·L-1,伏立康唑浓度相当于0.025,0.050,0.100,0.200,0.400,0.800,1.200,1.600mg·L-1的血浆样品;再按“1.5”项处理方法处理后,测定酮康唑峰面积AiT、伏立康唑峰面积AiF,内标峰面积As,以Ai/As为纵坐标,以所对应各点浓度(C)为横坐标绘制标准曲线。经最小二乘法线性回归,得酮康唑的标准曲线回归方程为C=6.835AiT/As+0.021,r=0.9999;伏立康唑的标准曲线回归方程为C=1.652AiF/As-0.004,r=0.9999。取标准曲线的最小浓度值为定量下限,酮康唑定量下限为0.25mg·L-1、伏立康唑的定量下限为0.025mg·L-1。取空白血浆1.0mL,加入相应的标准工作液,配制低、中、高3种浓度的血浆标准溶液,其中酮康唑浓度为0.50,4.00,12.00mg·L-1,伏立康唑浓度为0.05,0.40,1.20mg·L-1的血浆标准溶液。再按“1.5”项处理后,于同1d内测定5次和连续5d测定,计算日内、日间精密度,结果见表1。取空白血浆1.0mL,加入相应的标准工作液,配制低、中、高3种浓度的血浆标准溶液,其中酮康唑浓度为0.50,4.00,12.00mg·L-1,伏立康唑浓度为0.05,0.40,1.20mg·L-1。再按“1.5”项处理后,进样检测,计算检测量。以检测量与加入量的比值计算回收率,结果见表2。配制低、中、高3种浓度的血浆标准溶液,其中酮康唑浓度为0.50,4.00,12.00mg·L-1,伏立康唑浓度为0.05,0.40,1.20mg·L-1。3种浓度各5份,其中3份在室温下放置0,6,12h后再经血浆样品处理方法处理后进样检测,记录结果。另外2份分别在-65℃冰箱冰冻保存2周和4周后,再经血浆样品处理方法处理后进样检测,记录结果。酮康唑3个浓度的RSD分别为4.12%,2.81%,0.86%,伏立康唑3个浓度的RSD分别为4.32%,3.57%,1.32%。说明血浆样品在室温放置和冰冻保存的条件下,均有很好的稳定性。3分散药的制备1例健康志愿者单剂量口服400mg酮康唑片(西安杨森制药有限公司,批准文号:国药准字H10930212,批号:08061094)和200mg伏立康唑分散片(辉瑞制药有限公司,注册证号:H20040661,批号:080212),分别于给药前和给药后0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,4.0,6.0,8.0,12.0,24.0h取静脉血4.0mL,分离血浆。用此方法测得血浆中的酮康唑和伏立康唑浓度,绘制血药浓度-时间曲线见图1。4色谱-质谱条件的确定AgilentTC-C18的色谱柱使用超纯硅胶基质,具有高比表面积,12%碳载量和惰性表面,特别适合酸性、碱性和中性混合物的分离。在此色谱柱上,大部分成分有较好的保留,并且得到对称的色谱峰。本试验采用1%三氟乙酸调节流动相的pH值,比例为20%。在试验中发现,流动相中不加三氟乙酸时,只有内标卡马西平出峰,酮康唑和伏立康唑均不出峰;同时三氟乙酸的比例会影响酮康唑的峰面积,40%三氟乙酸时,酮康唑的峰面积下降30%,但不影响伏立康唑的峰面积。经过多次试验,确定流动相中三氟乙酸的比例为20%。文献报道单剂量口服400mg酮康唑的血浆峰浓度约为13mg·L-1,而单剂量口服200mg伏立康唑的血浆峰浓度约为1.0mg·L-1。两者在血浆中的浓度相差10倍,会导致酮康唑的峰很高,而伏立康唑的峰很小。本试验采用二极管阵列检测器的波长梯度的方法,得到了相对比例均衡的色谱图。DAD三维立体图显示,酮康唑在200～300nm波长均有吸收,在240nm有最大吸收,在294nm处吸收较小;伏立康唑在230和256nm处有最大吸收。故检测波长设为:0～6.5min,294nm;6.5～10.0min,256nm。卡马西平是常用的内标,在大多数色谱柱上都能很好的出峰,并且不受流动相酸碱度的影响,峰形对称;在整个紫外区具有吸收。无论在酸性条件还是碱性条件下,都有很高的萃取率。本试验建立的高效液相色谱法同时检测血浆酮康唑和伏立康唑浓度,专属性高,相对回收率均在85%～115%范围内,绝对回收率>75%;日内和日间变异均<10%,符合生物等效性研究的要求。操作简单,