牛卵母细胞的玻璃化冻融与体外受精

牛卵母细胞的玻璃化冻融与体外受精

目前，动物育种、果基因库的建立和发展非常迅速，但所需的大量卵母细胞来自屠夫场收集的卵母细胞。这就必然受季节变化导致卵母细胞质量改变和屠宰时间的限制,所以大大阻碍了研究工作的开展。而卵母细胞冷冻保存技术,可以为胚胎的体外生产及相关生物技术的研究提供充足的材料来源;同时也是保存品种资源的一种经济有效的手段。研究者借鉴传统胚胎冷冻方法,首先在小鼠和仓鼠卵母细胞冷冻保存中获得成功。十年后,利用同样方法冷冻人卵母细胞,受孕者妊娠并产下婴儿。但结果都表明卵母细胞冷冻保存效果远不及胚胎。家畜卵母细胞冷冻保存研究进展较慢,冷冻后卵母细胞的受精率、卵裂率和囊胚率都较未冷冻卵母细胞低,迄今只在兔和牛获得来自冷冻成熟卵母细胞的少数几个后代。近年研究表明,玻璃化冷冻方法可以避免在细胞内形成冰晶,降低低温对细胞产生的损伤,更适于卵母细胞冷冻保存。而牛卵母细胞对低温尤其敏感,发育到囊胚的比例仅为0%～10%,而且试验结果的重复性较差。因此,我们有必要深入探讨影响玻璃化冷冻保存卵母细胞的因素,为进一步提高牛卵母细胞冷冻保存效果提供理论基础和技术途径。1材料和方法1.1透明质酸酶去除卵丘细胞后的冷冻保存牛卵丘卵母细胞复合体(COCs)成熟培养参考Fuku等。将培养成熟的COCs用0.1%的透明质酸酶去除部分卵丘细胞后进行冷冻保存。试验中将卵母细胞体外分别培养0、4、8和15h后冷冻保存,解冻后移入成熟培养液中,分别继续培养22、18、14和7h(总培养时间约为22h)再进行体外受精。1.2母细胞的冷冻和解冻1.2.1u3000添加0.8mso和0.2的母液将四孔板(Co.Nunc)置于恒温台上,分别放置母液(含20%FCS、0.025mM/mLHepes和0.00596g/mL肝素的M199液)、VS1(含10%DMSO和10%EG的母液)和VS2(含20%DMSO、20%EG和0.3M蔗糖的母液)各0.8mL。将欲冷冻的卵母细胞先放在母液中,然后取2～4枚卵母细胞放在VS1中平衡一段时间,接着将卵母细胞连同尽量少的VS1放入VS2中,再将之连同1～2μL的VS2放入空白孔中,用毛细玻璃管(内径为0.8mm、长为10cm的高硼硅玻璃管)将卵母细胞吸入,立即投入液氮(从卵母细胞放入VS2到装管投入液氮整个过程在25s内完成)。1.2.2解剖和组织学检测在四孔板置于恒温台上,分别放置VS1、解冻液1(含0.3M蔗糖和20%FCS的M199液)、解冻液2(含0.15M蔗糖和20%FCS的M199液)和保持液(含20%FCS的M199液)各0.8mL。将毛细玻璃管从液氮中取出,在空气中停留3～4s,含液体的一端插入VS1中,在显微镜下观察到细管后用手指堵住细管的另一端,让卵母细胞流入四孔板中,确认数目后立即移入解冻液1中停留1min,然后移入解冻液2中停留5min,再移入保持液中停留5min,进行形态学评定。以解冻后卵丘细胞未脱落、透明带完整、胞质均匀的卵母细胞判为形态正常。选取形态正常卵进行体外受精。1.3精子浓度的确定15mL离心管内先加入1～2mL受精A液(含10mM咖啡因的BO液),然后取冷冻精液(试验所用精液来自同一头经过IVF测试的荷斯坦公牛)两管(Co.GRI)投入39℃烧杯内水浴解冻,至冰晶消失后用干酒精棉擦干管壁水珠,待酒精挥发后用剪刀剪掉冷冻管两端,将精液倒入离心管内,再添加A液至10mL左右。400r/min离心5min,快速移去上清,再离心一次并去掉上清。缓慢加入0.5mLA液与B液(含20mg/mLBSA和20μg/mL肝素的BO液)等体积的混合液,离心管呈30～40度角倾斜放置在39℃,5%CO2,100%湿度的培养箱内30min,待精子上游后取顶端液体进行精子记数并调整精子密度为106/mL,然后制作50μL精液小滴,上覆石蜡油。将成熟卵母细胞在受精混合液中洗三遍,然后放入精液滴中,每滴约15～20枚卵,在39℃,5%CO2,100%湿度的培养箱内培养。培养6h后将卵母细胞在mSOFaa液中洗三遍,然后放入20μLmSOFaa液滴中,每滴约10枚卵左右,隔天换半液,继续培养7～9d,在倒置显微镜下观察并记录发育到2-细胞、4-细胞、8-细胞和囊胚的数目。1.4an对s统计分析每组试验都重复3次以上。实验数据利用SPSS统计软件(SPSSInc.)的ANOVA模块分析。数据先经LSD转换后进行单因素方差分析,P<0.05为差异显著。2结果2.1冷冻解冻法为研究冷冻前平衡时间对牛成熟卵母细胞玻璃化冷冻保存的影响,我们将部分脱卵丘细胞成熟卵在VS1液中分别平衡0min、1min、3min、5min和10min,然后移入VS2液中装管冷冻,解冻时先移入VS1液中停留15s,对照组为未经冷冻的成熟卵母细胞。结果(表1)表明,平衡1min和3min组冷冻解冻后卵母细胞的形态正常率、2-细胞、4-细胞、8-细胞和囊胚发育率都较其他各组高(P<0.05),但都显著低于对照组(P<0.05);而且随着平衡时间(5min和10min)的延长,形态正常率和胚胎发育水平都逐渐降低。2.2抗冻保护剂对卵母细胞的影响a、b、c、d同一列数据中含相同字母者差异不显著(P>0.05),以下同为研究解冻时VS1液处理对牛成熟卵母细胞玻璃化冷冻的影响,我们将部分脱卵丘细胞成熟卵在VS1液中平衡1min后冷冻保存,解冻时分别在VS1液中处理0s、15s、30s和60s,然后依次移入蔗糖解冻液中脱除抗冻保护剂,对照组为未经冷冻的成熟卵母细胞。结果(表2)表明,VS1液中处理15s组卵母细胞的形态正常率、2-细胞、4-细胞和8-细胞率与未处理组(0s)差异不显著(P>0.05),但囊胚发育率较未处理组显著提高(P<0.05),分别为11.8±2.5%和4.9±0.7%;随着VS1液处理时间(30s和60s)的延长,形态正常率、2-细胞、4-细胞、8-细胞和囊胚发育率逐渐降低。2.3不同培养条件对卵丘卵母细胞的影响为确定冷冻时卵丘细胞对牛成熟卵母细胞玻璃化冷冻保存的影响,我们将未脱卵丘卵、部分脱卵丘卵和裸卵分别在VS1液中平衡1min后冷冻保存,解冻时在VS1液中处理15s,对照组为未经冷冻的成熟卵母细胞。结果(表3)表明,部分脱卵丘组卵母细胞的形态正常率、2-细胞、4-细胞、8-细胞和囊胚发育率显著高于未脱卵丘组和裸卵组(P<0.05)。2.4解冻卵母细胞为研究牛卵母细胞所处减数分裂阶段对玻璃化冷冻保存的影响,我们将卵母细胞在体外分别培养0、4、8、15和22h(其中15、22h组卵母细胞进行部分脱卵丘处理),然后在VS1液中平衡1min后冷冻保存,解冻时在VS1液中处理15s,对照组为未经冷冻的成熟卵母细胞。结果(表4)表明,卵母细胞体外培养15h以内,解冻后形态正常率与成熟22h组无显著差别(P>0.05);但2-细胞、4-细胞、8-细胞和囊胚发育率显著低于成熟22h组(P<0.05)。3讨论3.1冷冻和解冻卵母细胞的方法价值由于牛卵母细胞对低温特别敏感,实验表明,在25℃～4℃环境下停留1min即造成MⅡ期纺锤体去极化。而玻璃化冷冻法通过将卵母细胞悬浮于体积很小的液滴(1～2μL)中从而极大的提高降温速率,使卵母细胞越过“低温敏感区”,从而将冷冻造成超微结构的损伤降到最低程度。而且,由于液滴的体积非常小,冷冻或解冻时不致因为内外热传导不平衡造成透明带碎裂和质膜溶解。本试验中我们考虑到毛细玻璃管壁薄,导热性强,降温和复温速率快,因此采用毛细玻璃管作为冷冻保存卵母细胞的载体,解冻后形态正常率在90%以上,显然对卵母细胞的表观结构并未造成明显的破坏;囊胚发育率在10%左右,较前人研究没有明显提高。我们认为可能与卵母细胞的来源有关,试验中卵母细胞大部分取自屠宰场中性成熟前小母牛(<1.5岁)。已有报道表明,性成熟前小母牛卵母细胞的囊胚发育率显著低于成年牛。这从试验的对照组中也可看出,囊胚率(20%左右)明显低于其他报道中的比率(35%～50%)。3.2不同介质对树母细胞的催化作用许多报道中提出,玻璃化冷冻法存在的问题是玻璃化冷冻液不可避免地会对卵母细胞造成化学毒性损伤和渗透压损伤。因此,为缩短卵母细胞与玻璃化溶液接触时间,将其从生理溶液中直接移入玻璃化溶液中,然后立即投入液氮保存。但有报道认为这种处理方法造成解冻后卵母细胞形态正常率和胚胎发育率都较低。我们试验中结果也表明,直接将卵母细胞移入玻璃化溶液中冷冻保存,解冻后形态正常率明显降低,且无一例胚胎发育到囊胚。可能的原因是玻璃化溶液处理时间短,未能充分渗透到细胞内部,造成细胞内冰晶的形成,从而损伤细胞的超微结构。鉴于此目前大多数研究者采用分步平衡法处理卵母细胞,即先在含低浓度抗冻保护剂的溶液中平衡而不会导致毒性损伤,然后再移入玻璃化溶液中冷冻保存。我们试验中发现,卵母细胞在10%DMSO+10%EG液中平衡1～3min,冷冻效果明显提高,但随着处理时间的延长,冷冻效果逐渐降低。朱士恩等报道牛成熟卵母细胞在10%DMSO+10%EG液中平衡25～30s然后玻璃化冷冻,即能获得高比例的囊胚发育率。其他一些报道中也有采用处理5～10min不等的,这可能与选用的抗冻保护剂种类与浓度不同有关。3.3不同浓度蔗糖对卵母细胞的影响卵母细胞解冻时,即利用蔗糖的渗透压作用脱出细胞内部的抗冻保护剂,解除其对卵母细胞的毒性作用。然而,我们在试验中发现,解冻时将卵母细胞先移入10%DMSO+10%EG液中处理15s,然后依次移入不同浓度的蔗糖稀释液中,卵母细胞的形态正常率、2-细胞、4-细胞和8-细胞率与未处理组无差别,但囊胚发育率较未处理组显著提高,而且其结果的重复性强,这可能与缓解过度的渗透压刺激有关。3.4抗冻保护剂的使用与卵丘细胞的生迄今为止,卵丘细胞对成熟卵母细胞冷冻保存的影响并没有系统研究,绝大部分文献只在材料与方法中提到采用部分脱卵丘细胞的方法处理卵母细胞,即以卵母细胞周围留有2～3层卵丘细胞为宜。仅有一篇报道表明,部分脱卵丘细胞卵和裸卵对冷冻保存的牛卵母细胞孤雌激活后卵裂率和囊胚率无明显影响。说明带有部分卵丘细胞的卵母细胞玻璃化冷冻保存时,抗冻保护剂能充分渗透到细胞内,不会造成冰晶的形成。考虑到卵母细胞冷冻保存后主要用途之一是进行体外受精,而研究表明,卵丘细胞对成熟卵母细胞体外受精有重要作用。因此,卵母细胞冷冻时应保留全部或部分卵丘细胞。我们在试验中发现,对卵丘细胞不做处理,解冻后卵母细胞的形态正常率显著低于部分脱卵丘细胞卵。可能的原因是卵母细胞发育成熟后,卵丘细胞与卵母细胞的缝隙连接数量急剧下降,并且因粘液化和卵丘细胞扩张,卵母细胞和周围的卵丘细胞不再偶联,这时尤其是外围的卵丘细胞很容易散开并脱离卵母细胞,这样造成卵丘细胞层数不一致,冷冻时不能很好地控制平衡时间,致使卵母细胞受到损伤。而部分脱卵丘细胞卵因外围卵丘细胞层数基本一致,便于进行统一操作处理,冷冻效果较卵丘细胞不做处理组好。3.5冷冻保存时间对牛卵母细胞的影响已有研究表明,卵母细胞减数分裂阶段影响卵母细胞低温保存后的成活及后期发育。GV期卵母细胞较MⅡ期卵母细胞更难冷冻保存,经冷冻保存后会引起一系列的问题,如皮质颗粒外排、纺锤体受损、染色体分散进而导致受精率降低。Hochi等报道将牛卵母细胞体外分别培养0、6、12和24h后冷冻保存,发现卵母细胞培养12h