艾滋病、梅毒和乙肝检测方法介绍及选择

艾滋病、梅毒、乙肝检测方法介绍及选择湖北省疾病预防控制中心彭庭海2014年5月艾滋病、梅毒、乙肝--概况

艾滋病梅毒乙肝病原体HIV病毒梅毒螺旋体HBV病毒传染源HIV感染者/AIDS梅毒患者急慢性乙肝患者和携带者传播途径血液/性/母婴传播性/母婴传播/接触/血液血液/母婴传播/性预防献血员筛查/高危行为改变/孕妇筛查献血员筛查/高危行为改变/孕妇筛查主动免疫与被动免疫/孕妇筛查母婴传播艾滋病：约15～35%

HIV阳性孕妇会发生母婴传播。90%以上儿童HIV感染者是由母亲垂直传播而感染。梅毒：流产、早产、死胎或马鞍鼻、先天性耳聋等。乙肝：在我国，人群中40-50%是由母婴传播积累而成。

主要内容一.艾滋病实验室检测技术HIV抗体检测核酸检测CD4+T淋巴细胞检测二.梅毒检测技术显微镜检查法血清学检查法三.乙肝检测技术HBV免疫标志物检测HBV-DNA

一、艾滋病检测技术HIV抗体检测核酸检测CD4+T淋巴细胞检测HIV抗体检测筛查试验（包括初筛和复检）确证试验（WB）HIV抗体筛查样品

血清/血浆/全血滤纸干血斑唾液尿液筛查试剂

国家食品药品监督管理局注册批准有效期内酶联免疫试剂应批批检合格选择敏感性和特异性高的试剂筛查方法酶联免疫吸附试验（ELISA）化学发光或免疫荧光试验：采用发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。快速检测（RT）及其它检测试验

(1)明胶颗粒凝集试验(PA)(2)免疫渗滤试验

(3)免疫层析试验(1)酶联免疫吸附试验（ELISA）HIV抗体检测试剂：检测HIV-1/2抗体HIV抗原抗体联合检测试剂：可同时检测血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体用酶标仪测定结果四代艾滋病酶联免疫试剂比较solidphasespecificdetectionofconjugate第一代病毒裂解液HIV-1IgG抗体HIV-1-IgG抗体第二代病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2IgG抗体HIV-1/-2IgG抗体第三代病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2/-OIgM/IgG抗体HIV-1/-2/-O病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2/-O第四代病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-p24AbIgM/IgG抗体HIV-1/-2/-Op24抗原病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-p24抗体ELISA酶联免疫吸附实验

ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassayHIV抗原包被平板病人抗体酶显色剂+ve-ve阴性对照阳性对照阴性阳性质控酶联免疫吸附试验（ELISA）优点：准确性高、价格低廉、判断结果标准客观、结果便于记录和保存用途：流行病学监测及临床大量标本的检测(2)化学发光或免疫荧光试验采用发光或荧光底物既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体酶或荧光标记的HIV抗原或抗体，加发光或荧光底物用发光仪或荧光仪测定结果全血样品加50ul样品于样品垫中手指血方法静脉血方法加一滴缓冲液15分钟内读取结果（3）快速检测（RT）及其它检测试验快速检测（RT）及其它检测试验优点:试验简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测。不需专门设备和人员培训,一般可在10～30分钟内得出结果。缺点:肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。样品初筛试验一阴一阳均阳性反应报告阴性确证试验复检试验报告阴性均阴性反应阳性反应原有试剂＋另一不同原理（或厂家）试剂或另外两种不同原理（或厂家）试剂选用筛查试剂阴性反应HIV抗体筛查检测流程图HIV抗体确证试验确证试验的试剂：必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。确证样品：可采用血清、血浆、滤纸干血斑确证试验方法：免疫印迹试验(WB)、条带免疫试验(LIATEKHIVⅢ)、放射免疫沉淀试验(RIPA)及免疫荧光试验(IFA)。国内常用的确证试验方法是WB。HIV抗体确证实验结果a强阳性对照（HIV-1和HIV-2）b弱阳性对照（HIV-1）c阴性对照d典型的HIV-2血清阳性反应abcdgp160gp120p66p55p51gp41p39p31P24p17

血清对照HIV-2特异带初筛检测阳性标本两种筛查试剂报告阴性阴性反应一阴一阳阳性反应确证试剂复检试验根据具体情况进一步检测HIV-2报告阴性出现HIV-2指示条带阴性反应不确定反应报告HIV-1阳性HIV-1阳性反应结合流行病学资料，可以在4周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反应，则报告阴性；如随访期间出现阳性反应，则报告阳性；如随访期间带型有进展，但不满足阳性标准，应继续随访到8周。如带型没有进展或呈阴性反应则报告阴性；满足HIV抗体阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性判断标准可视情况决定是否继续随访。HIV抗体确证检测流程图产时艾滋病抗体检测及服务流程实验室需备有：1～2种HIV-1/2抗体ELISA（化学发光）试剂2种HIV-1/2抗体快速试剂百度“HIV抗体试剂临床评估”HIV抗体母亲HIV抗体经胎盘进入胎儿，出生时新生儿和婴儿早期抗体阳性，不一定是感染出生时母亲的抗体，80~90%在生后9~12个月消失，出生后18个月基本上全部消失18个月后儿童HIV抗体仍然阳性，视为自身感染产生的抗体18个月以下婴幼儿的HIV诊断婴幼儿HIV感染的抗体检测适用于：HIV感染产妇所生婴幼儿；母亲HIV感染状态不详，儿童出现HIV相关临床表现，临床怀疑HIV感染的儿童。婴儿12个月时进行HIV抗体检测

阴性排除感染，纳入正常儿童保健；

阳性者继续追踪随访，至18个月再次进行HIV抗体检测，结果阴性排除感染。艾滋病病毒感染产妇所生儿童阳阴用另一种不同原理或不同厂家生产的筛查试剂再次检测12个月进行HIV抗体筛查试验确证试验18个月时再进行HIV抗体筛查试验报告HIV抗体检测结果阴性艾滋病感染产妇所生儿童HIV抗体检测流程阳性阴性阴性阳性用另一种不同原理或不同厂家生产的筛查试剂再次检测阴性阴性阳性报告HIV抗体检测结果阳性提供咨询，继续随访，4周后再次进行确证试验不确定阳性18个月以下婴幼儿的HIV诊断核酸检测HIV前病毒DNA（HIVDNA）检测已整合到外周血液中血细胞基因组上的HIVDNA基于PCR技术高特异度(98%)和高灵敏度(>99%)18个月以下婴幼儿的HIV诊断HIV病毒载量（HIVRNA）用来监测已知的HIV感染病人的病毒载量试验；真阳性的结果通常>100,000拷贝/毫升,而假阳性结果<1,000拷贝/毫升RT-PCR、NASBA、CDNA、荧光定量PCR婴幼儿HIV感染的核酸检测可检测HIVRNA也可检测HIVDNA首选检测HIVDNAHIVDNA检测不受母亲围产期抗逆转录病毒治疗和人乳汁中抗逆转录病毒药物以及婴幼儿预防性抗逆转录病毒治疗的干扰考虑母亲血液污染因素，不推荐使用脐带血进行HIV核酸检测。婴儿的早期诊断

HIV感染母亲所生小于18个月龄的婴儿，不同时间的两次HIV核酸检测均为阳性即可作出诊断。18个月龄以上儿童诊断与成人相同：有急性HIV感染综合症或流行病学史，且不同时间的两次HIV核酸检测结果均为阳性，即可诊断。HIV感染产妇所生婴儿婴儿满3个月，再次采集血标本，送检尽快采集第二份血标本，送检出生后6周采集第一份血标本（可制备成滤纸片干血斑（DBS），或EDTA抗凝全血），送检继续随访报告阳性艾滋病感染产妇所生儿童HIV感染早期诊断检测流程呈阴性反应呈阳性反应呈阳性反应呈阴性反应呈阳性反应尽快再次采集血样，送检报告阴性呈阳性反应呈阴性反应呈阴性反应婴幼儿HIV感染的核酸检测需要注意：不同时间“婴儿HIV感染早期诊断”检测均呈阴性反应的喂哺母乳的儿童，应在完全停止喂哺母乳后的6周和3个月（若6周时检测结果为阳性可尽快）再次采血进行核酸定性检测。儿童满18个月后则可直接进行抗体检测。婴幼儿HIV感染的核酸检测方法

HIV-DNA1）RocheAmplicorHIV-1DNAPCR,version1.5试剂盒2）IN-HOUSE（国内开展，2009年检测技术规范）AmplicorHIV-1DNA简介样本：滤纸片干血斑、EDTA抗凝全血方法学：PCR-ELISA结果类型：定性靶物质：感染宿主细胞中的pro-viralHIV-1DNA滤纸片干血斑将全血滴在特定的滤纸片上制备。它主要应用于临床医学中新生儿先天性缺陷疾病的早期筛查。如：苯丙酮尿症，先天性甲状腺机能低下，维生素缺乏和一些感染性疾病的检测。

滤纸片干血斑用于婴儿HIV诊断样本量非常小，

(20lto200l)特别适宜采集婴儿样本。容易收集: 指尖血、后跟血。能提取全血，血浆、血清。短期运输可在常温下长期可贮存在–20C样本可在常温下运输:不需要干冰DBS可作为一种无感染性材料运输（在美国）滤纸片的选择

Whatman903滤纸片（可用于HIV抗体、HIV前病毒DNA和HIVRNA检测）FTA标准卡滤纸片（可用于HIV前病毒DNA检测）采集样本所需要的材料血样本采集卡片(滤纸片)；可密封的塑料袋；湿度指示卡；干燥剂（1-2g/袋）；怎样采集末梢血DBS应用通用的安全防护措施；清晰准确地在卡片上标记识别码；完成针刺指尖程序；均一地使每个印圈饱和地吸附血液；

两个充分吸附血液的印圈比五个不完全吸附的印圈要好怎样采集抗凝静脉血DBS静脉血充分与EDTA混合；最好采集后立即制备干血斑；血浆与血细胞分层的全血在制备干血斑前，应轻柔地上下颠倒采血管（避免血细胞破裂），使血液混匀后制备；用移液枪加代滤芯枪头移取75-80ul血液；枪头对准印圈的中心缓慢将血液滴于滤纸上；避免有气泡；怎样干燥DBS避免触摸或涂抹血斑；室温空气中水平干燥（至少4个小时）；避免阳光直晒；在干燥过程中不允许加热，叠加或将DBS接触其他表面；在包装前充分干燥DBS滤纸片干血斑的包装与运输将完全干燥的滤纸片干血斑样本用塑料袋进行独立包装，或者用秤量纸隔开，以避免样本之间的污染。已独立包装好的样本一起放入密封塑料袋中，加入几包干燥剂,加入湿度指示卡。将包装好的滤纸片干血斑，连同相应的文件（如采样/送样单等）放入大信封中。密封后可邮寄运输。放入密封袋加入干燥剂加入湿度指示卡标记袋中内容物核酸检测2次检测阳性可早期诊断HIV感染，如果不具备条件，也可用HIV病毒载量法来代替，2次检测阳性也可诊断HIV感染，18个月龄以后再做抗体检测确认。

HIV核酸定量检测

通过SFDA审批的试剂盒、方法

NASBAEasyQAmplicorTaqmanbDNA340440M2000PGCD4+T淋巴细胞检测CD4+T淋巴细胞计数广泛应用于HIV感染者的临床管理中，协助判断感染者的预后、指导实施抗病毒治疗和疗效观察以及药物预防机会性感染等方面。CD4+T淋巴细胞检测对于免疫功能相对较好，CD4+T淋巴细胞计数>350/mm3的艾滋病感染孕产妇，采用预防性抗病毒用药方案；对于CD4+T淋巴细胞计数≤350/mm3的艾滋病感染孕产妇，采用治疗性抗病毒用药方案。常规CD4+T淋巴细胞检测的方法和程序

流式细胞仪检测方法双平台方法单平台方法样品：EDTA、枸橼酸（ACD）或肝素抗凝全血运送条件：室温（18～25℃）保存和运输样品避免极端温度（结冰或大于37℃）高温季节，需用隔热容器盛装样品，并将其置于有冰袋和吸热物质的容器中。常规CD4+T淋巴细胞检测的方法和程序48小时内染色，染色后6小时内分析；如采血后24小时内染色，可在染色后24小时内分析；利用CD45单克隆抗体设淋巴细胞门，可检测放置72小时的样品；在