酶工程 第九章 酶分子修饰

酶分子修饰ModificationofEnzymeMolecule

限制酶大规模应用的原因1.易于变性失活（酸、碱、有机溶剂、热）；2.容易受产物和抑制剂的抑制；3.底物不溶于水，或酶的米氏常数过高；4.酶做为药物在体内的半衰期较短；5.已知酶种类及产物有限。1.通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。——蛋白质水平2.通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。——核酸水平

改变酶特性的两种主要方法

酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生改变，从而改变酶的催化特性的技术。知识回顾：酶的活性中心酶分子修饰的目的酶分子修饰的种类修饰酶的化学性质酶分子修饰的应用主要内容

一、活性中心的概念酶分子中的一小部分区域——

由酶分子中少数氨基酸残基参与组成与底物发生结合和催化作用与酶活力直接相关

第一节酶的活性中心（activecenter）二、酶活性中心的共性

1.酶的活性中心是由必需基团(essentialgroup)构成的与酶催化活性有关的特定区域，其构象不是固定不变的（诱导契合）。Theactivesiteistheregionoftheenzymethatbindsthesubstrate,toformanenzyme-substratecomplex,andtransformsitintoproduct.酶分子非必需基团必需基团活性中心必需基团活性中心外必需基团结合基团催化基团非活性中心活性中心7种氨基酸出现的频率最高:Lys、Asp、Glu、Cys、His、Tyr、Ser某些功能基团（如氨基、羧基、巯基、咪唑基和羟基）是酶的必需基团。

活性中心的重要化学基团半胱氨酸谷氨酸丝氨酸组氨酸天冬氨酸赖氨酸酪氨酸2.活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。3.活性部位是一个三维实体。Theactivesiteisoftenacleft

orcreviceonthesurfaceoftheprotein,inwhichthesubstrateisboundbymultipleweakinteractions.4.活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。5.酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。1.物理学方法2.化学修饰法3.动力学参数法4.蛋白质工程

三、研究酶活性中心的方法

用X射线衍射法直接检测底物或其类似物与酶形成的中间复合物（包括酶和底物）的相对位置。

1.物理学方法2.化学修饰法根据所用修饰试剂不同，分为:

1)非专一性化学修饰用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。若修饰后：

酶活性不变——修饰基团可能不是酶的必需基团

酶活性降低或丧失——修饰基团可能是酶的必需基团，但不能确定是否同活性中心内的必需基团结合。2)专一性化学修饰基团专一性修饰用专一性化学修饰剂修饰酶分子中的某一特定氨基酸残基的侧链基团。位点专一性修饰(亲和标记）利用酶对底物的特殊亲和力修饰酶分子活性中心的某一特定氨基酸残基的侧链基团。

亲和修饰剂：①与底物结构相似，与活性中心的氨基酸残基亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸残基亲和力小。②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性中心的基团形成稳定的共价键。亲和标记（位点专一性修饰）化学修饰的专一性3.动力学参数法

pH-酶活力关系的研究，可得到参与反应的必需基团的pK值，通过比较分析估计基团的种类。4.蛋白质工程将酶相应的cDNA定点突变，突变的cDNA只表达一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，测定其活性可知被置换的氨基酸是否为活力所必需。一、酶分子修饰的目的1.研究酶的结构与功能的关系（上世纪50年代）探测酶活性必需氨基酸的性质和数目酶蛋白一级结构的测定酶蛋白的结构变化与运动酶蛋白部分区域的构象状态酶的作用机理与催化反应历程酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态酶的固定化技术酶纯度的分析与检测第二节酶分子修饰的目的和原理2.人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围（上世纪70年代）1.提高酶的生物活性（酶活力）2.增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）3.消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）4.产生新的催化能力第三节酶分子修饰的种类一、金属离子置换修饰二、酶分子的化学修饰三、酶分子的物理修饰一、金属离子置换修饰P136（metalionsubstitutemodification）

将酶分子中的金属离子置换为另一种金属离子，使其催化特性发生改变的修饰方法。1.方法：

酶的分离纯化

除去原有金属离子：加入金属螯合剂，去除螯合物加入置换离子2.作用：阐明金属离子对酶催化作用的影响提高酶的催化效率增强酶的稳定性

改变酶的动力学特性1.酶的表面化学修饰（1）大分子结合修饰（2）侧链基团修饰（小分子修饰）（3）交联法（4）固定化修饰（共价结合法）2.酶分子内部修饰（1）肽链有限水解修饰（2）核苷酸链剪切修饰（3）氨基酸置换修饰（4）核苷酸置换修饰二、酶分子的化学修饰（1）大分子结合修饰P138（macromoleculescombinemodification）

利用水溶性大分子与酶的侧链基团结合，使酶的空间结构发生改变，从而改变酶的催化特性的方法。

修饰剂：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、糖肽（glycopeptide）等。

修饰方法：修饰剂选择，修饰剂活化，修饰，分离。①聚乙二醇的修饰反应聚乙二醇（PEG，Mw1000-10000）：线性大分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性。单甲氧基聚乙二醇（MPEG）：

CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH修饰方法：重氮法、叠氮法、琥珀酸酐法、三氯均三嗪法。重氮法叠氮法琥珀酸酐法三氯三嗪法例：聚乙二醇化学修饰超氧化物歧化酶（SOD）超氧化物歧化酶(SOD)：生物体内重要的自由基清除剂，催化超氧阴离子(O2-)的歧化反应，能缓解许多由自由基介导的炎症反应，减轻组织缺血性损伤，预防和治疗辐射损伤。临床应用：延缓人体衰老，防止色素沉着，消除局部炎症，特别是治疗风湿性关节炎、慢性多发性关节炎及辐射防护。缺陷：半衰期短、稳定性差、免疫原性。SOD作用机制修饰方法修饰剂选择：单甲氧基PEG(mPEG)修饰剂活化：烷基化修饰：活化后的修饰剂与蛋白上赖氨酸残基的ε-氨基或N末端氨基反应，形成稳定的连接体分离：凝胶层析效果：抑制免疫反应的产生，提高抗酶水解能力，延长半衰期修饰原理PEG与蛋白的非必需基团结合后，分子表面形成一个PEG保护层，作为一种屏障挡住蛋白分子表面的抗原决定簇，避免抗体的产生或者阻止抗原和抗体的结合而抑制免疫反应的产生。由于这种保护层的形成保护了该酶免受体内水解酶的消化，表现了较强的抗酶水解能力。蛋白经PEG修饰后分子量增加，分子的体积增大，肾小球过滤减少，可以避免被肾脏很快地排除，因而其血浆存留时间得到显著延长，有助于蛋白药物循环半衰期的延长。②糖类的修饰反应：右旋糖苷修饰反应右旋糖苷：

-葡萄糖通过-1,6-糖苷键连接而成，双羟基经过活化后可与酶分子上的游离氨基相结合。修饰方法：溴化氰法、高碘酸氧化法。-NH2糖肽（Glycopeptide）的修饰反应:

糖肽：人纤维蛋白或-球蛋白经蛋白酶水解后得到的产物，分子上的游离氨基活化后可与酶分子上的氨基反应。修饰方法：异氰酸法、戊二醛法。聚乳糖修饰反应：聚乳糖在一定温度下，通过适当的还原剂可与酶分子上氨基反应。③其他合成大分子多聚物的修饰反应(1)聚N-乙烯吡硌烷酮(PVP):用水溶性的分子量为10,000的PVP，经过开环水解活化后，与酶结合。(2)聚乙烯醇(PVA):PVA与对硝基苯氧酰氯反应，其硝基再用连二亚硫酸钠还原为氨基，与酶分子中的羧基共价连接。(3)聚丙烯酸(PAA):用分子量为250,000的PAA，经过N-羟基琥珀酰亚胺活化后与酶的氨基反应。(4)聚顺丁烯二酸酐:用分子量为98,000的聚顺丁烯二酸酐，可以直接与酶分子的氨基发生反应。(5)聚氨基酸：用分子量为5,700的聚赖氨酸做修饰剂时，其氨基与酶分子上的羧基通过羰二亚胺产生交联。用丙氨酸的二肽或三肽做修饰剂时，其酸酐可以与酶发生反应。④天然大分子对酶的修饰反应肝素由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成，平均分子量约为20000，是一种含硫酸酯的黏多糖。经过肝素修饰的酶具有良好的稳定性，不仅可以提高酶的疗效，而且具有抗血凝、抗血栓、降血脂等活性。修饰方法：三氯三嗪法、溴化氰法④天然大分子对酶的修饰反应人血清白蛋白：包含585个氨基酸，分子量为66kD

临床应用：治疗休克与烧伤，用于补充因手术、意外事故或大出血所致的血液丢失，也可以作为血浆增容剂修饰方法：戊二醛法、活性酯法提高酶的催化效率水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合后，一定程度上改变了酶的空间构象，有利于活性中心与底物结合并发挥催化作用⑤大分子结合修饰的作用增强酶天然构象的稳定性与耐热性——修饰剂与酶形成多点交联，使酶的天然构象“刚性”增加。保护酶活性部位与抗抑制剂——大分子修饰剂产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂。维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶——大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶；敏感基团交联上修饰剂后受蛋白水解酶破坏的可能性减小。

稳定酶的微环境——大分子修饰剂（多聚电荷体）在酶分子表面形成“缓冲外壳”增强酶的稳定性酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。

破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除

遮盖了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合降低或消除酶蛋白的抗原性⑥大分子结合修饰的应用

PEG-超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）

PEG-溶血类蛋白质（链激酶Streptokinase,SK;尿激酶urokinase,UK等）

PEG-天门冬酰胺酶（Asparaginase,ASNase）消除了抗原性延长了酶在体内的半衰期用Dextran修饰

-淀粉酶，-淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶：提高了酶的热稳定性。（2）侧链基团修饰（小分子修饰）P141（sideresiduesmodification）通过化学修饰剂使酶分子侧链基团发生改变，从而改变酶的催化特性的修饰方法。

侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基等。

20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。

侧链基团修饰剂：小分子化合物

根据氨基酸侧链R基的极性，20种氨基酸可分成4类。非极性R基氨基酸（共9种）：甘氨酸(Glycine,Gly,G)

丙氨酸(Alanine,Ala,A)

亮氨酸(Leucine,Leu,L)

缬氨酸(Valine,Val,V)

异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I)

苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F)

脯氨酸(Proline,Pro,P)色氨酸(Tryptophan,Trp,W)

甲硫氨酸(Methionine,Met,M)

无电荷的极性R基氨基酸（共6种）：丝氨酸(Serine,Ser,S)

苏氨酸(Threonine,Thr,T)

酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y)

半胱氨酸(Cysteine,Cys,C)

天冬酰胺(Asparagine,Asn,N)

谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)

带正电荷的极性R基氨基酸（共3种）：赖氨酸(Lysine,Lys,K),

精氨酸(Arginine,Arg,R),

组氨酸(Histidine,His,H)带负电荷的极性R基氨基酸（共2种）：天冬氨酸(Asparticacid,Asp,D),

谷氨酸(Glutamicacid,Glu,E)烷基化反应酰化反应氧化还原反应芳香环取代反应①几种重要的修饰反应烷基化反应试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如-NH2，-SH等）发生烷基化。可作用基团：氨基（Lys），胍基（Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu），咪唑基（His）。修饰剂：2,4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。烷基化反应酰基化反应试剂特点：含有结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。可作用基团：氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟基（Tyr）修饰剂：乙酰咪唑、二异丙基磷酰氟、酸酐磺酰氯等酰基化反应氧化和还原反应试剂特点：具有氧化性或还原性。氧化剂：H2O2，N-溴代琥珀酰亚胺可被氧化的侧链基团：巯基、甲硫基、吲哚基、咪唑基、酚基等。还原剂：2-巯基乙醇、DTT等。可被还原的侧链基团：二硫键。连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。芳香环取代反应试剂：卤（碘）化、硝化试剂

（四硝基甲烷）I2++HI(NO2)4C+

+(NO2)3CH②特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰氨基的化学修饰：来源：Lys修饰反应：酰基化、烷基化修饰剂:

三硝基苯磺酸（TNBS）、2,4-二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等三硝基苯磺酸2,4-二硝基氟苯碘乙酸羧基的化学修饰修饰羧基的反应专一性较差。常用水溶性碳二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸，可定量测定酶分子中羧基的数目。+碳二亚胺巯基的化学修饰

来源：Cys

修饰反应:烷基化修饰剂：碘乙酸(IAA)

碘乙酰胺(IAM)

E-SH+R-XE-S-R+HXN-乙基马来酰亚胺（NEM）：常用的专一修饰巯基试剂E-SH+

胍基的化学修饰来源：Arg修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化。修饰剂：丁二酮二羰基化合物1，2-环己二酮苯乙二醛酚羟基的化学修饰来源：Tyr修饰反应：芳香环取代反应修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷）I2++HI咪唑基的化学修饰

来源：His

修饰反应:酰基化、烷基化

酰基化修饰剂:焦碳酸二乙酯（diethylparacarbonate）

+

+C2H5OH+CO2

烷基化修饰剂：碘乙酸+ICH2COOH

+HI吲哚基的化学修饰

来源：Trp

修饰反应：氧化反应修饰剂：

N-溴代琥珀酰亚胺二硫键的化学修饰还原：巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）氨基酸侧链基团修饰剂Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸Asp/Glu羧基水溶性碳二亚胺Arg胍基苯乙二醛，1,2-环己二酮、丁二酮Cys巯基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺二硫键巯基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羟基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亚胺

各种氨基酸侧链的修饰剂

对修饰效果的解释须十分小心：①任何一种修饰剂不是绝对专一的。②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活，不一定是活性中心基团被共价修饰。③不同部分的相同基团，修饰效