单细胞测序技术样本

单细胞测序一一最值得尖注的测序技术101/31生物探索单细胞测序I全基因组测序I转录组测序随着现代生物学的发展，细胞群体的研究已不再能满足科研需求。单细胞测序解决了用导组织样本测序或样本少时无法解决的细胞异质性难题 ，为科学家研究解析单个细胞的行过去二十几年里，随着基因测序技术水平的提高以及千人基因组计划、癌症基因组计划、Meta・Hit计划等重大国际合作项目的相继开展，基因组研究日渐被推向高潮。然而，迄今为止使用的测序材料无一例外都是数百万甚至更多细胞的混合DNA羊本。这种方法能够得到全基因组序列信息，可是对其进行研究得到的结果只是一群细胞中信号的平均值，或者只代表其中占优势数量的细胞信息，单个细胞独有的特性被忽视。例如，科学家想找出哪种突变存在于哪种细胞中几乎是不可能的，只存在于少数细胞（如早期癌细胞）中的突变也基本上被掩藏。另一方面，有些样品稀少无法在实验室培养，样品量不足以进行全基因组分析：例如肿瘤循环细胞、组织微阵列、早期发育的胚胎细胞等。这些都是全基因组测序遇到的难题。作为"在单个细胞水平上对基因组进行测序的单细胞测序技术能够解决上述难题。与传统的全基因组测序相比，单细胞测序不但测量基因表示水平更加精确：而且还能检测到微量的基因表示子或罕见非编码 RNA,其优势是全方位和多层次的。,《自然方法》杂志(NatureMethods)W单细胞测序列为年度值得期待的技术之一(1)，，《科学》杂志(Scienee)将单细胞测序列为年度最值得尖注的六大领域榜首⑵。与此同时，测序巨头相继推出新一代测序仪，为单细胞测序提供利器，越来越多与单细胞测序有尖的研究也发表在顶级期刊上 ,这些都表明，单细胞测序已逐渐成为科研热点，有望成为最值得尖注的测序技术。单细胞测序基本路线近年来，流式细胞分选和激光捕获显微切割技术的出现让单细胞的捕获成为可能。单细胞测序技术正逐渐从实验研究方法成为指导临床的有利工具，为基础研究向临床转化搭建了桥梁。单细胞测序主要涉及单细胞基因组测序和转录组测序两方面，分别针对单个细胞的DNA和RNAS行序列分析和比较，进而揭示基因组和转录组的变化。单细胞全基因组测序单细胞全基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA®行扩增,获得高覆盖率的完整的基因组之后经过外显子捕获进而高通量测序用于揭示细胞群体差异和细胞进化尖系。全基因组扩增技术主要分为两种类型：一是基于热循环以PCR为基础的扩增技术，如简并寡核背酸引物PCRDOP-PCR、连接反应介导的PCF(LM-PCR)扩增前引物延伸反应(PEP)等；一是基于等温反应不以PCF为基础的扩增技术，如多重置换扩增(MDA)和基于引物酶的全基因组扩增(pWGA)。在这两种类型中,PCR扩增比较经典，可是，对不同的序列来说，PCR扩增的效率存在相当大的偏差，易产生扩增偏倚问题：女口富含CG的DNA序列和相应基因座位的非随机丢失，等位基因的非随机丢失，以及与DNA片段大小相尖的偏差(倾向于扩增更多短片段)，特别是在应用于单细胞时，大量短片段导致片段间序列丢失，从而使其应用受限。MD/是当前公认的最好的单细胞基因组扩增技术，它能对全基因组进行高保真的均匀扩增，扩增出10-100kb大小的片段，能提供大量均一完整的全基因组序列。可是MDA也有一些缺点，特别是显著的非特异扩增，往往空白对照样品也总是”无中生有”地产生大量的DNA,另外就是依然存在序列偏差。尽管各种改进的策略正在逐步减少这些缺陷，高覆盖率、高保真性及高特异性的扩增依然是亟待解决的问题。另外，对测序得到的大量数据结果的专业分析也是一个重大的挑战。单细胞全基因组测序正在从基础研究走向临床应用。单细胞转录组测序单细胞转录组分析主要用于在全基因组范围内挖掘基因调节网络，特别适用于存在高度异质性的干细胞及胚胎发育早期的细胞群体。与活细胞成像系统相结合单细胞转录组分析更有助于深入理解细胞分化、 细胞重编程及转分化等过程及相尖的基因调节网络。将此技术应用于临床，理论上能够在生理或病理情况下连续追踪基因表示的动力学变化，从而监测疾病的进展。单细胞转录组分析的另一应用领域是发现亚细胞成分的基因表示谱，例如对在神经元的轴突或树突部分特异表示的基因的转录组的分析，这些基因往往对细胞的生物学功能发挥着重要作用。可是，鉴于当前的技术手段，单细胞转录组测序依然存在覆盖率低的弊端,导致除mRN以外的长非编码RNAst以检测，而且不能区分正义链与反义链。最近发展的单分子测序技术无需逆转录和扩增步骤而直接对单个细胞的全长mRNA进行测序，从而准确地检测基因不同的剪切亚型的表示水平。随着技术的发展这些局限性会被逐步优化和改进。单细胞测序技术实例多重退火和成环循环扩增技术(MultipleAnnealingandLooping-BasedAmplificationCycles,MALBAC)主要研发人：哈佛大学终身教授、美国科学院院士谢晓亮(SunneyXie)教授技术看点：降低PCRT增偏倚，使得单细胞中93%勺基因组能够被测序。这种方法使得检测单细胞中较小的DNA序列变异变得更容易，因此能够发现个别细胞之间的遗传差异。这样的差异能够帮助解释癌症恶化的机制，生殖细胞形成机制，甚至是个别神经元的差异机制。技术简介：PCRT增具有偏好型而且基因组具有大量的冗余，造成了基因组测序准确性不高。谢晓亮研发的MALBA技术能从一个细胞的基因组中，分离出来自单细胞的DNA,然后添加称作引物的短DNA分子。这些引物可与DNA的随意部分互补，从而使得它们能够附着到DNA链上，充当DNA复制起点。这些引物由两个部分构成 个包含8个核昔酸的粘性部分变化多样，可与DNA结合，再加上一个包含27个核昔酸的共同序列。这一共同序列可防止 DNA太多次拷贝，大大地降低了扩增偏倚。经过将自身掺入到新拷贝链，从而自身成环，防止了过度拷贝。利用这种方法，进行与加入的引物的DNA复制时，能够完成高达93%勺基因组测序。技术论文：技术论文：Genome-WideDetectionofSingle-NucleotideandCopy-NumberVariationsofaSingleHumanCell基于芯片实验室技术的单细胞测序主要研发人：斯坦福大学StephenQuake技术看点：基于labonachip开发技术简介：本技术设计了一种路线,用液体载运细胞经过一连串显微管道和微阀门，当细胞挨个进入各自的小空位时，它们的DNA就会被提取出来，经过复制用于进一步分析。另外，本技术不但能分离细胞，还能用化学试剂将细胞混合起来，经过检测反应过程中的荧光发射获得它们的基因编码。所有这些都能在芯片上完成，不但操作简单，而且成本效益高。StephenQuake已利用此技术完成了第一例人类单细胞测序，现在她正利用这项技术研