堆肥用木质纤维素降解菌筛选技术规程

DB13/Txxx—2020PAGE1堆肥用木质纤维素降解菌筛选技术规程1范围本标准规定了堆肥用木质纤维素降解菌菌株筛选的样品采集、培养基配制、富集培养、菌株分离、初筛、复筛、菌株综合鉴定，以及筛选菌株的保藏技术等。本标准适用于农林牧及加工业的有机废弃物堆肥、农作物秸秆还田，及其它行业和生活垃圾的有机废物中木质纤维素降解与资源化利用领域。本标准不适用于厌氧发酵和其他材料及形式的处理与利用。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489-2008实验室生物安全通用要求GB7959-87粪便无害化卫生标准GB/T25246-2010畜禽粪便还田技术规范GB/T25169-2010畜禽粪便监测技术规范GB/T26622-2011畜禽粪便农田利用环境影响评价准则NY884-2012 生物有机肥GB4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》GB15618-2018土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准GB/T36195-2018畜禽粪便无害化处理技术规范HJ497畜禽养殖业污染治理工程技术规范NY/T1168畜禽粪便无害化处理技术规范NY/T3442-2019畜禽粪便堆肥技术规范NY/T3441-2019蔬菜废弃物高温堆肥无害化处理技术规程HJ1088-2020排污单位自行监测技术指南磷肥、钾肥、复混肥料、有机肥料和微生物肥料NY/T525-2021有机肥料3缩略语下列缩略语适用于本文件。TSA：胰蛋白胨大豆琼脂培养基；TSB：胰蛋白胨大豆液体培养基；GSM：高斯氏合成培养基；GGSM：改良高斯氏合成培养基；PDA：马铃薯葡萄糖琼脂培养基；PDB：马铃薯葡萄糖液态培养基；CMC-Na：羧甲基纤维素钠；DNA：脱氧核糖核酸；rDNA：核糖体DNA；ITS：内转录间隔区；PCR：聚合酶链式反应；CMCase：羧甲基纤维素酶；FPA：滤纸酶；Lip：木质素过氧化物酶；Mnp：锰过氧化物酶；Lac：漆酶；PBS：磷酸缓冲液；ABTS：2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸。4菌株筛选包括样品采集、各种筛选培养基制备、木质纤维素降解菌的富集与分离、菌株初筛与复筛。4.1样品采集从养殖场、有机肥厂、菌菇厂、垃圾填埋场、污水处理厂、林地和农田等采集发酵过程中的粪便、堆肥、菌菇发酵料、活性污泥以及林下腐殖土和耕层土壤等样品，将样品按类别、采样点和采样时间做好标记，当天带回实验室，在24h内进行富集或分离培养。4.2筛选培养基配制木质纤维素富集培养基：秸秆末（滤纸浆粉）5g，蛋白胨5g，NaCl5g，CaCO32g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，蒸馏水1000mL。TSA培养基：TSA粉30g，蒸馏水1000mL。TSB培养基：TSB粉30g，蒸馏水1000mL。GSM培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5g，氯化钠0.5g，七水硫酸镁0.5g，七水硫酸亚铁0.01g，琼脂20g，水1000mL，pH7.2~7.4。GGSM培养基：KNO31g，KH2PO40.5g，NaCl0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，可溶性淀粉20g，酵母膏1g，葡萄糖10g，蒸馏水1000mL，pH7.2-7.4。PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL。PDB培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。CMC刚果红培养基：(NH4)2SO42.0g，MgSO4·7H2O0.5g，K2HPO41.0g，NaCl0.5g，CMC-Na2.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。另配制1mg/mL刚果红染液和1mol/LNaCl溶液。木质素苯胺蓝培养基：(NH4)2SO42g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，NaCl0.5g/L，碱性木质素5g/L，琼脂粉22g/L，H2O950mL；苯胺蓝粉末0.25g溶于50mL无菌水中，用一次性医用注射器吸取苯胺蓝染液，再装上无菌过滤器注入灭菌后的培养基中趁热于超净台中混合均匀。木质素亮蓝培养基：(NH4)2SO42g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，NaCl0.5g/L，碱性木质素5g/L，亮蓝0.25g，琼脂粉22g/L，H2O1L。亮蓝的除菌方法同苯胺蓝。发酵培养基：麸皮50g，蛋白胨3g，(NH4)2SO43g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.3g，NaCl5g，水1000mL。滤纸条崩解培养基：KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.4g，(NH4)2SO43g，酵母粉0.1g，H2O1000mL。秸秆降解培养基：玉米秸秆粉2%，蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，(NH4)2SO40.4%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O0.05%，pH值7.2~7.4。上述培养基于121℃高压灭菌30min，冷却至55~60℃倾注平板备用。4.3富集培养称取各类样品各20g，充分打散混匀；称取2份10g混合样品，分别放入2个灭菌的含100mL木质纤维素富集培养液的250mL锥形瓶中，两瓶分别于35℃和45℃、160r/min摇瓶48h。4.4分离纯化将富集培养液摇匀，各取1.0mL悬液置于含9mL无菌水的离心管，摇匀后得10﹣1稀释液，依此倍比稀释至10﹣5稀释液；分别从两个温度富集培养液及其系列稀释液（100~10﹣5）中取100µL菌悬液，均匀涂布于细菌、放线菌、真菌分离培养基平板，每个稀释度重复2次，将富集培养液的稀释平板分别置于35℃和45℃条件下恒温培养1~7d。在培养期间每天观察菌落生长情况，并从适当稀释平板上挑取不同形态单菌落，在新的分离培养基平板上划线分离纯化培养；重复以上操作至得纯菌株。4.5初筛将分离纯化的菌株分别接种于CMC刚果红培养基、木质素苯胺蓝培养基、木质素亮蓝培养基上。每个平板接种一株菌，均匀分散点接三个点，两个平行，35℃培养3d。在明亮背景下观察、测量不同培养基上各菌落及其周围透明圈的直径大小，并计算同一菌株菌落直径（d）、透明圈直径（D）的平均值以及D/d的比值。刚果红培养基上的透明圈需染色才能看到：将配制的刚果红染液倒入平板中染色10~15min，倒去染液，加入NaCl溶液显色15min即可。按菌株在初筛培养基上的菌落直径、透明圈直径、D/d值、透明圈清晰度对每个菌株进行积分，将同类菌株的积分进行比较，选择积分较高的菌株进入复筛。4.6复筛4.6.1酶活测定将初筛入选菌株分别进行CMCase、FPA、Lip、Mnp和Lac酶活性测定。CMCase测定：采用3,5-二硝基水杨酸法测定内切-β-1,4-葡聚糖酶催化羧甲基纤维素钠降解产生的还原糖的含量。Cx(μg/(min·mL))=1000×(ΔA+0.0673)÷6.4078×V总÷V样÷T=14.305×(ΔA+0.0673)。FPA测定：滤纸酶水解滤纸产生的还原糖能与3,5-二硝基水杨酸生成红棕色氨基化合物，在540nm处有最大光吸收，在一定范围内反应液颜色深浅与还原糖的量成正比，可测定计算滤纸酶的活力。FPA(U/ml)=(ΔA+0.0255)÷0.2805×V总÷V样÷T=0.416×(ΔA+0.0255)。上述公式中，V总：反应体系总体积(mL)；V样：加入反应体系中样本体积(mL)；T：反应时间(min)；ΔA：测定组与对照组的吸光值差。Lip测定：采用木质素过氧化物酶活性检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）检测。木质素过氧化物酶氧化藜芦醇生成藜芦醛在310nm处有特殊吸收峰。将菌株发酵培养液超声波冰浴破碎菌体，然后10000g离心10min，取上清液100μL装入2mL离心管中，放置于冰上待测。反应体系含有1mM藜芦醇，50mMpH7.2的磷酸缓冲液（PBS）和0.1mM过氧化氢，总体积1mL。超纯水作为对照，分别测定310nm处反应10S和310S的吸光值，分别记为A1和A2，ΔA=A2-A1。酶活性定义为每升培养液60S内氧化1nmol藜芦醇所需酶量为一个酶活力单位，藜芦醛摩尔消光系数ε=9300L·mol-1·cm-1。计算公式如下：Lip(nmol·min-1·L-1)=ΔA÷(ε×d)×V总÷V样÷TMnp测定：锰过氧化物酶也是一种含有亚铁血红素的氧化酶，在Mn2+存在的条件下将愈创木酚氧化为四邻甲氧基连酚，在465nm处有特征吸收峰。使用木质素锰过氧化物酶活性检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）进行测定。将发酵培养液10000g离心10min，取上清液作为粗酶液放置于冰上待测。反应样品100μL，底物反应体系900μL，充分混匀反应体系与样品，在37℃反应10min，于1mL玻璃比色皿中，蒸馏水调零，测定465nm处吸光值，计算与对照组差值ΔA。酶活性定义：每升培养液每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。愈创木酚消光系数ε=12100L·mol-1·cm-1，计算公式如下：Mnp(nmol·min-1·L-1)=ΔA÷(ε×d)×V总÷V样÷TLac测定：漆酶是含铜的多酚氧化酶，具有较强的氧化能力。使用漆酶活性检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）测定。漆酶分解ABTS产生ABTS自由基，在420nm处吸光系数远大于ABTS，测定ABTS自由基增长率得到漆酶活性。离心后粗酶液0.1mL，加入反应体系液0.6mL，对照组样品煮沸后加入。样品加入后在60℃水浴3min，测定其420nm处吸光值，计算与对照组的差值ΔA。ABTS消光系数ε=36L·mmol-1·cm-1。定义每毫升每分钟氧化1nmol底物ABTS时所需的酶量为一个酶活单位。计算公式如下：Lac(U·L-1)=ΔA÷(ε×d)×V总÷V样÷T上述公式中d：比色杯光径；V总：反应总体积；V样：反应中样品体积；T：反应时间。4.6.2秸秆降解率测定将玉米秸秆粉碎后于105℃烘干至恒重，配制秸秆降解培养基备用。将初筛入选菌株接种于相应种子培养基（TSB、GGSM、PDB），在35℃、150r/min摇瓶培养24~72h；取菌悬液按2%接种率接种到装有150mL秸秆降解培养基的250mL锥形瓶中，35℃摇床培养5d。培养结束后，在锥形瓶中加入装液量20%的中性洗涤剂（3%十二烷基硫酸钠），煮沸10min以便除去可溶性物质。将培养液用质量恒定（m0）滤纸进行过滤，经蒸馏水冲洗过滤后，将滤纸和滤渣置于105℃烘箱中干燥至恒重（m2）。质量恒定后的m2−m0即为降解剩余物质量m1。玉米秸秆木质纤维素降解率Y计算公式为：Y=(m-m1)/m×100%公式中m：培养基中初始玉米秸秆的质量（g）。将复筛菌株的CMCase、FPA、Lip、Mnp和Lac酶活性值和秸秆降解率进行积分，比较同类菌株间复筛积分高低，并结合初筛结果对复筛菌株进行取舍。5菌株的综合鉴定包括形态学和分子生物学鉴定。参照GB19489-2008实验室生物安全通用要求的相关条款。5.1菌株形态特征将复筛入选菌株以平板划线的方法接种于相应的培养基，于恒温培养箱中倒置培养，24～72h后观察各菌株在平板上的菌落形态特征；挑取菌体进行涂片染色，细菌用革兰氏染色法，放线菌用结晶紫染色，真菌用苯胺蓝染色，镜检观察菌体显微形态特征，结合菌株的典型菌落形态和菌体形态特征进行初步鉴别。5.2菌株的分子生物学鉴定5.2.1基因组DNA提取细菌、放线菌DNA的提取：将1mL的TSB液体培养基放入2mL的EP管中，用接种环挑取纯化完成的单个菌落放入其中，35℃，160r/min培养过夜。将培养好的菌液12000r/min离心5min，弃上清；加入1mL无菌水，震荡混匀，12000r/min离心3min后弃上清，重复2次。加入30-50µL的无菌水，震荡混匀，98℃水浴，细菌水浴15min，放线菌水浴35min。水浴完成后，12000r/min离心2min，上清液即为提取的细菌DNA，取上清移入新的EP管中，-20℃保存备用。真菌DNA的提取：真菌的DNA提取采用北京索莱宝生物科技有限公司的真菌试剂盒，按说明书指导方法进行提取。5.2.2引物合成细菌和放线菌采用16SrDNA通用引物，真菌采用真核生物rDNA的ITS序列通用引物，引物由华大基因公司合成，引物序列如下表：表1引物序列菌株上下游引物细菌上游引物：5’-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3’下游引物：5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’真菌上游引物ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’下游引物ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’放线菌上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’下游引物1492R：5’-GGTTAC