体外哺乳动物细胞染色体畸变实验

九、体外哺乳动物细胞染色体畸变实验InVitroMammalianCellsChromosomeAberrationTest1范围本标准规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变实验的大体原那么、要求和方式。本标准适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。2标准性引用文件OECDGuidelinesforTestingofChemicals(,July1997)3实验目的本实验是用于检测培育的哺乳动物细胞染色体畸变，以评判受试物致突变的可能性。4概念染色体型畸变(Chromosome-typeaberration):染色体结构损伤，表现为在两个染色单体相同位点均显现断裂或断裂重组的改变。染色单体型畸变(Chromatid-typeaberration):染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。染色体数量改变(Numericalaberration):所用细胞株的正常染色体数量的转变。结构畸变(Structuralaberration):在细胞割裂的中期相时期，用显微镜检出的染色体结构改变，表现为缺失、断片、互换等。有丝割裂指数(Mitoticindex):中期相细胞数与所观看的细胞总数之比值；是一项反映细胞增殖程度的指标。5实验大体原那么在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培育的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中期割裂相阻断剂(如秋水仙素或秋水仙胺)处置，使细胞停止在中期割裂相，随后收成细胞，制片，染色，分析染色体畸变。6实验方式试剂和受试物制备阳性对照物：可依照受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，阳性对照物应是已知的断裂剂，能引发可检出的、并可重复的阳性结果。当外源性活化系统不存在时，可利用甲磺酸甲酯(methylmethanesulphonate(MMS))、甲磺酸乙酯(ethylmethanesulphonate(EMS))、乙基亚硝基脲(ethylnitrosourea)、丝裂霉素C(mitomycinC)、4-硝基喹啉-N-氧化物(4-nitroquinoline-N-oxide)。当外源性活化系统存在时，可利用苯并(a)芘[benzo(a)pyrene]、环磷酰胺(cyclophosphamide)。阴性对照物：应设阴性对照，即仅含和受试物组相同的溶剂，不含受试物，其它处置和受试物组完全相同。另外，如未能证明所选溶剂不具有致突变性，溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显不同，还应设空白对照。受试物受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物能够直接加入实验系统和/或用前稀释至适合浓度。受试物应在利用前新鲜配制，不然就必需证明贮存不阻碍其稳固性。溶剂的选择：溶剂必需是非致突变物，不与受试物发生化学反映，不阻碍细胞存活和S9活性。首选溶剂是培育液（不含血清）或水。二甲基亚砜（DMSO）也是经常使用溶剂，利历时浓度不该大于％。受试物浓度设置（1） 最高浓度的选择：决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在实验系统中的溶解度和pH或渗克分子浓度（osmolality）的改变。（2） 细胞毒性的确信：应利用指示细胞完整性和生长情形的指标，在活化系统存在或不存在的两种条件下确信细胞毒性，例如细胞覆盖程度（degreeofconfluency）、存活细胞计数（viablecellcounts）或有丝割裂指数（mitoticindex）。应在预实验中确信细胞毒性和溶解度。（3） 剂量设置：①至少应设置3个可供分析的浓度。当有细胞毒性时，其浓度范围应包括从最大毒性至几乎无毒性；通常浓度距离系数不大于2~血。在收成细胞时，最高浓度应能明显降低细胞覆盖程度、细胞计数或有丝割裂指数（均应大于50%）。关于那些相对无细胞毒性的化合物，最高浓度应是5ul/mL，5mg/mL或L。关于相对不溶解的物质，当浓度低于不溶解浓度时仍无毒性，那么最高剂量应是，当处置期终止时，在最终培育液中溶解度限值以上的一个浓度。在某些情形下（即仅当高于最低不溶解浓度时才发生细胞毒性），应利用一个以上可看见沉淀的浓度。最好在实验处置开始和终止时均评判溶解度，因为由于细胞、S9等的存在，在实验系统内在暴露进程中溶解度可能转变。不溶解性可用肉眼辨别，但沉淀不能阻碍观看。培育液：采纳MEM（Eagle），并加入非必需氨基酸和抗菌素（青、链霉素，按100IU/mL），胎牛血清或小牛血清按10%加入。也可选用其它适合的培育液。活化系统通常利用的是S9混合物（S9mix）。、9是从经酶诱导剂（Aroclor1254或苯巴比妥钠和B-萘黄酮联合利用）处置的啮齿动物肝脏取得的oS9的制备同Ames实验。S9的利用浓度为1%~10%（终浓度）。S9mix中所加辅助因子的量由各实验室自行决定，但需对S9mix的活性进行鉴定，必需能明显活化阳性对照物。也可利用下述S9MgC12（mol/L） mlKC1（L） ml葡萄糖-6-磷酸辅酶11（氧化型，NADP）用无血清MEM培育液补足至1mL.实验步骤细胞：利用中国地鼠卵巢（CHO）细胞株或中国地鼠肺（CHL）细胞株。实验时，应同时设阳性对照物，阴性对照物和至少3个可供分析的受试物浓度组。实验前一天，将必然数量的细胞接种于培育皿（瓶）中，放CO2培育箱内培育。实验需在加入和不加入S9mix的条件下进行。实验时，吸去培育皿（瓶）中的培育液，加入必然浓度的受试物、S9mix（不加S9mix时，需用培育液补足）和必然量不含血清的培育液，放培育箱中处置2h~6h。终止后，吸去含受试物的培育液，用Hanks液洗细胞3次，加入含10%胎牛血清的培育液，放回培育箱，于24h内收成细胞。于收成前2h~4h，加入细胞割裂中期阻断剂（如用秋水仙素，作历时刻为4h，终浓度为1^g/mL）。当受试物为原料时，若是在上述加入和不加入S9mix的条件下均取得阴性结果，那么尚需补加另外的实验，即在不加S9mix的条件下，使受试物与实验系统的接触时刻延长至24h。当难以得出明确结论时，应改换实验条件，如改变代谢活化条件、受试物与实验系统接触时刻等重复实验。收成细胞时，用%胰蛋白酶溶液消化细胞，待细胞脱掉队，加入含10%胎牛或小牛血清的培育液终止胰蛋白酶的作用，混匀，放入离心管以1000r/min~1200r/min的速度离心5min~7min，弃去上清液，加入LKC1溶液低渗处置，继而以新配制的甲醇和冰醋酸液（容积比为3:1）进行固定。按常规制片，用姬姆萨染液染色。作染色体分析时，对每一处置组选200个（阳性对照可选100个）分散良好的中期割裂相（染色体数为2n±2）进行染色体畸变分析。在分析时应记录每一观看细胞的染色体数量，关于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型。统计处置：对染色体畸变细胞率用X2查验，以评判受试物的致突变性。结果评判：在以下两种情形下可判定受试物在本实验系统中具有致突变性：（1） 受试物引发染色体结构畸变数的增加具有统计学意义，并有与剂量相关的增加。（2） 受试物在任何一个剂量条件下，引发具有统计学意义，并有可重复性的阳性反映。在评判时应把生物学和统计学意义结合考虑。7实验报告实验报告应包括以下内容：（1）受试物名称、有关的理化性状、所用溶剂及其配制、剂量选择（应说明受试物对细胞毒性的测定方式、溶解情形等）（2） 细胞株名称；（3） 实验条件和方式代谢活化系统：制备禹时所用酶的诱导剂、选用的动物品种和来源、S9mix的配方；对照物：阳性对照物名称和选用浓度；阴性（溶剂）对照物名称及利用浓度。培育液：所用培育液名称、血清类别和利用浓度；接种时的细胞密度和所用培育皿（瓶）的规格；中期割裂阻断剂：名称、所用浓度、作历时刻；处置时刻：受试物与实验系统的接触时刻；简述制片方式、分析的中期割裂相数量、结果评判方式。（4） 结果受试物最高剂量的确信及实验结果：细胞毒性的测定（建议的表格见表1）；溶解情形（建议的表格见表2）；对pH和渗克分子（osmolality）浓度的阻碍（若是有阻碍）。遍地理组和对照组染色体畸变率（建议的表格见表3）。本实验室的阳性对照组和阴性对照组（经常使用溶剂，如DMSO）在本实验室历史上的染色体畸变率范围、均值和标准差（说明样品数）。（5） 结论。表1受试物对细胞的毒性受试物浓度Ug/mL活细胞计数法分裂指数法细胞覆盖程度接种细胞数/mL活细胞数/mL存活率%计数细胞数中期分裂相数分裂指数表2受试