高产香乳酸菌菌株的选育

高产香乳酸菌菌株的选育HJ14mm]收稿日期：2016-06-20基金项目：安阳工学院农产品加工与贮藏重点学科项目。近年来，随着科学技术和人民生活水平的提高，人们对酸奶营养成分的关注意识逐步增强，对酸奶的外观特性（风味、口感、品质）也是越来越重视。但是酸奶具有良好的风味和营养价值，这无疑使其在快节奏的生活中占据了越来越重要的地位。各种各样的添加剂赋予了酸奶良好的风味，但是人们更为担心的是这些添加剂会给人带来的负面影响，于是对乳酸菌的品质提出了更高要求。菌株的发酵性能直接影响到酸奶的发酵质量，对酸奶的产香也有很大的影响。应用于乳制品加工的发酵微生物主要是乳酸菌，构成牛乳主体香味的物质主要是双乙酰、乙醛、二甲硫醇、脂肪酸、酮类、内酯等。其中，？0橹破废阉镀鸬街饕?调节作用的是双乙酰和乙醛。嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌分别为双乙酰和乙醛的主要产生菌种1-2]。本研究选取从市售酸奶中分离筛选出的产香性能较好的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为出发菌株，通过紫外诱变，筛选出高产香菌株，并将其应用于酸奶发酵中，提高酸奶的品质。1材料与方法11材料与试剂菌株：从市售花花牛酸奶中分离得到保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。主要试剂：脱脂乳粉，食品级，内蒙古伊利实业集团XX公司；花花牛酸奶，食品级，河南花花牛乳业XX公司；葡萄糖，分析纯，天津北辰方正试剂厂；吐温80、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏，生物试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司；磷酸氢二钾、硫代硫酸钠，分析纯，天津市北方化玻购销中心；乙酸钠，分析纯，北京北化化学品有限责任公司；硫酸镁，分析纯，北京57601化工厂；硫酸锰，分析纯，河南焦作市化工三厂；邻苯二胺，分析纯，三远化工XX公司。12仪器与设备DZKW-S电热恒温水浴锅，上海新苗医疗器械制造XX公司；LDZH-100KBS立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂;XSP-1C电子显微镜，浙江宁波市镇海中华电子仪表厂；ZXGP-A2160电热恒温培养箱，上海智城分析仪器制造XX公司；TU-1810DASPC分光光度计，上海精密科学仪器XX公司；22331超高速冷冻离心机，德国艾本德股份公司；SW-CJ-2FD垂直流双人单面超净工作台，上海新苗医疗器械制造XX公司；CBIO-UV8C紫外线诱变箱，北京赛百奥科技XX公司。13试验方法该试验的具体技术路线如下：从酸奶中分离出保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌3-5］，从中选出产双乙酰和乙醛较好的菌株，经过增菌培养富集菌体，再离心获得菌体6］，通过不同条件的紫外线诱变7-14］得到诱变菌株，并对其产香性能进行测定15-20］，选出优良产香菌株。131主要培养基1311脱脂乳培养基配制方法按1g：10mL的比例将适量的脱脂乳粉加蒸馏水溶解，密封置于灭菌锅中115°C蒸汽灭菌10〜15min，经高压灭菌后置于冰箱中备用。1312MRS培养基固体MRS培养基：胰蛋白胨10g,酵母浸膏5g，牛肉膏10g，琼脂20g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g,葡萄糖20g，吐温801mL，硫酸镁058g，硫酸锰025g，蒸馏水1L，121C高压灭菌20min。液体MRS培养基的配制参照固体培养基，将上述固体MRS培养基中的琼脂去掉。1313M17培养基固体M17培养基：胰蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母浸膏5g，硫酸镁0258，廿油10g，乳糖3g，磷酸氢二钾5g，琼脂20g，蒸馏水1L。液体M17培养基只需将上述固体M17培养基中的琼脂去掉。132菌种分离将菌种稀释成不同稀释梯度的菌悬液。用移液枪分别吸取10-4、10-5、10-63个试管中的菌悬液01mL滴在MRS、M172种固体培养基表面中央位置，用无菌玻璃涂布棒将菌液均匀涂开，静置数分钟，使菌液浸入培养基。将平板倒置，放入恒温培养箱中37C培养2d。133保加利亚乳杆菌的诱变前准备用上步中得到的保加利亚乳杆菌菌株制作发酵剂，并活化3代，以2%接种量将菌种接入灭菌脱脂乳中，37°C培养16h20],通过检测脱脂乳的酸度、产乙醛的量，确定产香性能好的菌株作为出发菌株。将纯化的出发保加利亚乳杆菌菌种接种至配制的MRS液体培养基。37C培养24h后每隔4h取出2个试管作为平行组，滴定检测其酸度，绘制保加利亚乳杆菌的生长曲线。根据上述绘制的生长曲线，选取对数生长之后的保加利亚乳杆菌培养液，在4C下4000rmin离心20min,弃去上清液，用无菌水洗涤菌体，收集菌体并倒入平板，为诱变做准备。 134保加利亚乳杆菌的紫外诱变将倒入平板的菌液于垂直距离紫外灯20cm处下开盖照射120s，紫外线波长分别为254、365nm。将倒入平板的菌液在波长为365nm的情况下，竖直距离紫外灯15、20cm处照射120s诱变。将倒入平板的菌液于波长为365nm，距离紫外灯20cm处，分别照射60、120、180s。将未经照射的和经过紫外照射的菌液分别计数，计算致死率。致死率二(未照射菌数-照射后菌数)未照射菌数]X100%。从致死率90%左右的平板中，挑选5个单菌落，接种至脱脂乳中培养至凝乳，测定产乙醛性能。135嗜热链球菌的产香性能测定将分离纯化得到的嗜热链球菌疑似菌株，活化3代后，接种至脱脂乳，42°C培养14h后1],检测产双乙酰的量，确定产双乙酰量最多的作为出发菌株。136嗜热链球菌的诱变前准备及诱变嗜热链球菌的诱变前准备方法与保加利亚乳杆菌相同，只是将MRS培养基改为M17培养基。嗜热链球菌接下来的操作参照保加利亚乳杆菌的处理。14评价指标测定方法保加利亚乳杆菌乙醛产量的检测参照刘鹏等的检测方法20]。嗜热链球菌双乙酰产量的检测参照王丹等的检测方法17]。用吉尔涅尔度（°T）来表示滴定酸度。采用MRS培养基、M17培养基测定酸奶中乳酸菌总菌数。吸光度的测量采用分光光度计，波长335nm。2结果与分析21菌种分离通过菌种分离，得到了保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。分离效果见图1、图2。FK（W12]TPDL1tif]22保加利亚乳杆菌的诱变与检测221保加利亚乳杆菌产香菌株的初步筛选从纯化后的平板上取10个疑似目标菌落，活化3代以后，分别接种至脱脂乳培养基中，37C培养16h，检测其产乙醛的情况（表1）。从表1可以看出，2号菌株的产乙醛量明显优于其他菌株，为（1265±017）MgmL，确定2号菌株为出发菌株。222保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌生长曲线的绘制保加利亚乳杆菌的生长曲线见图3。从图3可以看出，单个菌种的生长曲线都呈现先增加后平缓的趋势，并且2个菌种都是在32h左右滴定酸度的变化不再明显，可以确定32h为菌种繁殖量最大的时间点。选取32h作为制备菌悬液的最佳时间。223保加利亚乳杆菌的紫外诱变按照前述的诱变方法，保加利亚乳杆菌的诱变结果见表2。随着紫外波长的增大，致死率逐渐增大，因此选择致死率最大的365nm为最佳诱变剂量；垂直诱变距离为15cm时的致死率相对较高，为935%，因此选择15cm为最佳诱变剂量；诱变时间为120s时致死率相对较高，为984%，而且菌株生长更好，因此选择120s为最佳诱变剂量。综上所述，保加利亚乳杆菌的最佳诱变参数为紫外波长365nm、垂直?T变距离15cm、诱变时间120s。224诱变之后保加利亚乳杆菌的产香检测从诱变后筛选出的高死亡率的平板中分别挑出5个保加利亚乳杆菌菌株，接种至脱脂乳中活化3代，然后按2%的剂量接种到脱脂乳培养基，37°C下培养16h，菌株的产香情况见表3。从表3可以看出，诱变波长为365nm时，菌株的产乙醛量有升高也有降低，其中L-21、L-24的产乙醛量较出发菌株均下降；菌株L-22的产乙醛量相对较高，为最佳菌株。诱变距离为15cm时，保加利亚乳杆菌的产乙醛量均有上升，其中菌株L-2a的产乙醛量最高，确定为最佳菌株。诱变时间为120s时，保加利亚乳杆菌的产乙醛量有升高也有降低，其中菌株L-2D的产乙醛量最高，菌株L-2C的产乙醛量下降，确定L-2D为最佳菌株。23嗜热链球菌的诱变与检测231嗜热链球菌产香菌株的初步筛选从纯化的平板上挑取10个嗜热链球菌疑似菌株，活化3代后，按2%的接种量接种至脱脂乳中42°C培养14h，检测其产双乙酰的情况(表4)。从表4可以看出，1号菌株的产双乙酰量相对较高，为(296±016)MgmL，因此确定ST为出发菌株。232嗜热链球菌的紫外诱变参照保加利亚乳杆菌的紫外诱变方法，嗜热链球菌的诱变情况见表5。从表5可以看出，紫外波长为365nm的时候，菌株的致死率相对较高，为955%，因此确定波长365nm为最佳诱变剂CM(25］量。当垂直照射距离为15cm时，紫外诱变的致死率相对较高，为953%，因此选取垂直照射距离15cm为最佳诱变剂量。诱变时间为120s时，紫外诱变致死率高，为961%，因为选取120s为最佳诱变剂量。综上所述，嗜热链球菌的最佳诱变参数为紫外波长365nm、垂直照射距离15cm、诱变时间120s。233诱变之后嗜热链球菌的产香检测从诱变后致死率高的平板中分别挑出5个疑似嗜热链球菌菌株，接种至脱脂乳中活化3代，然后按2%的剂量接种到脱脂乳培养基，42°C下培养14h,菌株的产香情况见表6。从表6可以看出，紫外诱变波长为365nm时，各个菌株的产双乙酰量均有所增加，其中S-14的产双乙酰量最高，所以选取S-14作为最佳菌株。垂直照射距离为15cm时，各个菌株的产双乙酰量均有所增加，其中菌株S-1d的产双乙酰量明显最高，所以选取S-1d为最佳菌株。诱变时间为120s时，各个菌株的产双乙酰量均有所下降，特别是S-1C菌株，产双乙酰量最少。3结论(1)从市售花花牛酸奶中通过菌种分离和产香检测，筛选出高产乙醛的L-2菌株和高产双乙酰的S-1菌株作为出发菌株，其中L-2的产乙醛量为1265pgmL，S-1的产双乙酰量为296pgmL。通过确定最佳诱变参数(紫外照射波长365nm、垂直照射距离15cm、紫外照射时间120s)，筛选出了保加利亚乳杆菌L-22、L-2a、L-2D为3个诱变情况下产乙醛量最高的菌株，产量分别为1351、1652、1446pgmL，相比出发菌株L-2，分别增加了68%、306%、143%。与保加利亚乳杆菌同样的诱变剂量，筛选出了嗜热链球菌S-14、S-1d的产双乙酰量分别为336、416pgmL，较出发菌株分别增加了135%、405%。在产量