长春龙嘉国际机场口岸犀携带病原菌基因组dna提取方法比较

长春龙嘉国际机场口岸犀携带病原菌基因组dna提取方法比较

著名的动物是世界上最重要的卫生害虫之一。不仅食品和非食品材料，它不仅会造成损失，还会导致大量细菌传播各种疾病。随着经济全球化,进出口贸易的增加,交通工具和运输设施的快捷、便利,使得蜚蠊及其卵鞘隐藏在各类货物、行李、集装箱中,经过交通工具,在地区间,乃至国际间广泛传播、扩散。随着这些货物、行李等,蜚蠊又悄悄地进驻各类建筑物,潜入到各行各业中。本研究利用1年时间,对长春龙嘉国际机场口岸的蜚蠊进行了本地调查,掌握了蜚蠊的种群构成、季节消长规律等基本情况,并对三种提取蜚蠊表面携带病原菌基因组DNA的方法进行了比较,为今后蜚蠊携带病原菌的检测提供了帮助。1本研究1.1调查地点与方法采集地点:根据长春龙嘉国际机场口岸地区的具体情况结合蜚蠊的生态习性,选择口岸内4种生境分别为办公区、食品生产厂区(包括机场食品公司A、食品公司B)、餐饮业(包括机场宾馆C、餐厅D、咖啡厅E)、仓储场地(包括货运仓库F、货运仓库G),共8个监测点,作为采集地点。采集方法:采用“盒式诱捕法”方法。在调查区共设150个点,每个点放一个诱捕盒,置于食源丰富潮湿背光隐蔽处。选用规格为15cm×10cm,高为3cm诱捕盒,在诱捕盒对应两壁正中下方,用新鲜面包2g左右作为诱饵,每次捕集12小时,晚放晨收。将捕获的蜚蠊进行种群分类、标本制作并进行携带病原菌的检测。诱捕盒底层具有较强粘性,蜚蠊一旦进入则被粘住,从而达到捕获的目的。1.2第1批的密度计算蜚蠊构成比的计算:构成比(%)=某种蜚蠊只数捕获总的蜚蠊只数×100%(%)=某种蜚蠊只数捕获总的蜚蠊只数×100%蜚蠊密度的计算:D=ΝcΝe‚DD=NcNe‚D为密度,单位为只每盒(只/盒),Nc粘捕到的蜚蠊数,单位为只。Ne粘捕到蜚蠊的粘蟑盒数,单位为盒。1.3添加溶菌猪肉、碱蛋白、gn增菌液、缓冲蛋白成分配比的确定在上述不同场所捕获蜚蠊200只,分别用无菌镊子夹取10只为1组,共20组放入灭菌三角瓶中,加入营养肉汤50mL,反复振荡洗涤体表5min,各取1mL洗脱液分别接种溶菌肉汤、碱性蛋白胨水、GN增菌液、缓冲蛋白胨水做增菌培养。1.4组基因组dna提取方法的比较病原菌基因组DNA的提取质量直接影响用PCR或者基因芯片等分子生物学方法对病原菌的检测效果,因此,本研究采用煮沸法、试剂盒法、SDS法三种基因组DNA提取方法进行比较。1.4.1pbs-1缓冲液制备取1mL菌液于离心管中,12000rpm,离心5min,弃上清,加PBS缓冲液1mL,12000rpm,离心5min,弃上清,加150微升双蒸水,混匀,封口膜封口,100℃煮沸10min后,12000rpm,离心10min,将上清转移至新的离心管中,-20℃保存备用。1.4.2测试盒法细菌DNA的提取按照EasyPureTMGenomicDNAExtractionKIT试剂盒使用说明中的操作规程进行提取。1.4.3盐藻dna的提取取1mL～2mL菌液至EP管中,10000rpm离心,沉淀菌体;加入200μL裂解液,(0.1MNaOH,1MNaCL,5%SDS),加热煮沸20min;加入三倍体积0.1MTris-Hcl(ph7.4),离心5000rpm,5min;上清液用等体积的酚-氯仿抽提8000rpm,10min;无水乙醇沉淀DNA,室温静置10min,或5000rpm,离心5min,沉淀DNA;离心收集,用70%乙醇漂洗两遍,开盖晾干乙醇;加30μlddH2O,-20℃保存。1.4.4dna纯度、浓度计算及纯度取细菌DNA5μL,在紫外分光光度下,分别取波长为260nm,280nm两个波段,测得其相应的DNA的OD260值及OD280值。利用公式:DNA浓度(ng/μl)=50ng/μL×OD260,计算出DNA浓度;利用公式:DNA纯度=OD260/OD280,计算出DNA的纯度。计算结果采用SPSS16.0软件进行完全随机设计的方差分析进行比较。2结果2.1物种组成、密度和季节变化规律2.1.1不同的飞克集团2008年4至2009年3月,共捕获蜚蠊3957只。经鉴定均为德国小蠊。德国小蠊构成比100%。2.1.2监测点点分布根据监测场所的性质,此次调查共分为4个不同生境,分别为办公区、食品生产厂区(包括机场食品公司A、食品公司B)、餐饮业(包括机场宾馆C、餐厅D、咖啡厅E)、仓储场地(包括货运仓库F、货运仓库G),共8个监测点。经监测,在不同生境下,办公区共捕获蜚蠊225只,密度0.32只/盒;仓储场地共捕获蜚蠊0只,蜚蠊密度0只/盒;餐饮区共捕获蜚蠊3470只,蜚蠊密度4.08只/盒;食品生产单位共捕获蜚蠊262只,密度为0.34只/盒。整个口岸蜚蠊密度为1.36只/盒,结果见表1。2.1.3乔木密度季节的消长变化规律2008年4至2009年3月,经过春、夏、秋、冬四个季节,共12个月的调查结果分析,1月份和7月份为蜚蠊密度高峰期,见表2,图1。2.2病原菌基因组dna纯度、浓度检测测量提取的DNA样本在260nm,280nm处的吸光度值。用OD260/OD280表示DNA的纯度,OD260×50表示DNA的浓度(ng/μl),对提取的DNA浓度和纯度进行比较,结果显示煮沸法、试剂盒法、SDS法三种方法提取病原菌基因组DNA的纯度分别为1.715±0.155、1.750±0.108、1.840±0.051,通过方差分析,三种方法具有显著性差异(F=11.697,P<0.05),SDS法提取的DNA纯度较好。煮沸法、试剂盒法、SDS法三种方法提取病原菌基因组DNA浓度分别为57.347±8.212ng/μL、1.883±0.782ng/μL、14.925±3.338ng/μL,通过方差分析,三种方法具有显著性差异(F=637.137,P<0.05),可知煮沸法浓度最高,结果见表3。综合比较,纯度、浓度、成本、提取时间等因素,SDS法是比较理想的病原菌基因组DNA提取方法。3讨论3.1应注重在国际机关分布的生长和季节动态吉林省属于温带大陆性季风气候,四季分明,冬季长而寒冷,夏季短而温暖,春秋季风大,平均气温-3℃～7℃。一年四季温差、湿度差较大,但北方的供暖设施致使常年室温在20℃以上,近年来城市集中供热的改造使得楼与楼之间形成高温、高湿的通道。这些特点致使蜚蠊的季节消长受外界环境温度变化的影响不明显,在一些特定的环境下,蜚蠊终年可以繁殖。长春龙嘉国际机场位于长春、吉林两市之间,地处九台地区。属半湿润温带大陆性季风气候。年均气温4.7℃,年日照时数2615.5小时,无霜期139天左右,年平均降水量573.2毫米。而德国小蠊的适应性极强,这些特点为其繁衍生殖提供了良好的孳生条件。本研究中,在长春龙嘉国际机场口岸蜚蠊本底调查中捕获到的蜚蠊均为德国小蠊,这个结果与2000年长春市防疫站调查的蜚蠊分布界限基本吻合,即以长哈铁路和伊通河为界,铁路北侧、伊通河东只有德国小蠊1种;铁路以南伊通河以西4种均有且除美洲大蠊与黑胸大蠊不共栖外,其他各种均可共栖,但从未发现3种以上共栖的。与2006-2007年吉林省疾控中心调查的吉林省蜚蠊分布情况一致,该研究调查中发现长春市蜚蠊种类仅有德国小蠊存在,本研究结果说明长春龙嘉国际机场口岸的蜚蠊以德国小蠊为优势种属。此次调查在长春龙嘉国际机场口岸中德国小蠊的年平均密度为1.36只/盒,此结果低于长春市蜚蠊密度3.62只/盒,说明长春龙嘉国际机场口岸的蜚蠊侵害程度要低于长春市区,提示应加强在长春龙嘉国际机场口岸蜚蠊的防控工作,采取相应措施,防止口岸蜚蠊密度的上升,从而达到保护口岸人民群众及出入境旅客生命财产的安全。蜚蠊的活动受湿度的影响,表现出明显的季节消长现象—出现、增多、高峰、下降和越冬,这种规律在我国的大部分国境口岸都很明显。南方各口岸地处亚热带,蜚蠊季节消长现象突出,但不一定越冬,北方各口岸,蜚蠊季节消长和越冬明显,但在冬天有取暖设施的场所,或温湿度较高的房间,蜚蠊可终年活动,无明显季节变化。在首都机场危害高峰为8月份,南京禄口机场为6月和9月份,浦东机场为8月份,广州白云机场为7月、9月和11月份。在东北,如吉林省长白口岸、集安口岸,即使室外气温在-20℃以下,但室内很暖和,所以蜚蠊照常活动。本研究中,长春龙嘉国际机场口岸蜚蠊活动分别在1月份和7月份出现两次高峰,其他月份无明显变化,这个结果与吉林省疾病预防控制中心调查的吉林省蜚蠊高峰出现在3月份和7月份的结论基本一致。蜚蠊的季节变化规律有助于提示口岸相关单位在蜚蠊活动高峰时期应加大控制措施,预防因蜚蠊引起的疾病在口岸传播。3.2种基因组dna提取方法比较PCR检测方法的可靠性主要依赖于模板DNA的质量,因此DNA的提取方法在PCR检测中起着重要作用,细菌DNA提取方法有多种,不同的方法提取的量及纯度不同,所需要的时间及经费也有差别,目前细菌DNA常采用经典的有机溶剂提取法。经典的有机溶剂法虽然得到的DNA质量较高,但是步骤繁琐耗时长,不适于快速检测中DNA的提取。本研究对蜚蠊表面携带的病原菌基因组DNA采用了3种不同的提取方法即煮沸法、试剂盒法、SDS法。从提取的基因组DNA的纯度和浓度以及时间经济等角度出发,比较了三种基因组DNA提取方法。结果显示,煮沸法的操作步骤简洁、时间较短,费用低,减少了DNA损失及外源DNA的污染机会,不需要酚-氯仿抽提及乙醇沉淀,避免了有机溶剂对人体的危害,而且得到的DNA的产量高,但由于煮沸法并没有去除杂质的过程,提取纯度及效率明显偏低,因此高温煮沸法虽然简单,但纯度较低,仅适合于对模板要求较低的实验,而且有文献报道煮沸法无法提取革兰阳性菌基因组DNA,在检测鉴定中可能会因此造成假阴性。GenomicDNAExtractionKIT试剂盒法操作步骤相对煮沸法和SDS法较为复杂,整个提取过程时间较长。由于提取方法中需经多步洗脱,转移,容易使DNA损失,导致DNA产量较少,且费用昂贵,不适于大量标本处