粗线期染色体技术在原位杂交及生物图谱中的应用

粗线期染色体技术在原位杂交及生物图谱中的应用

1分散成像技术的发展1.1粗线期染色体在一般的原位异交技术中，以中期染色体（mei综合征）为目标dna的载体。由于染色体结构高度浓缩，其分辨率仅为1.3mb。然而这对于构建高分辨率的DNA物理图谱来说,1~3Mb的分辩率水平是还不够的,必须寻找分辨率更高的技术。而减数分裂的粗线期染色体(pachytenechromosome)浓缩程度比中期染色体大为降低,具有提高原位杂交分辩率的潜力。粗线期染色体还具有可识别的结构特征,包括着丝粒位置、短臂和长臂的比例、异染色质和常染色质的形态等,另外,粗线期染色体所在的细胞几乎不存在细胞壁,染色体伸展良好,且同源染色体配对提供了两个目标点使目标区域增加了一倍,以上这些特点说明了粗线期染色体可适用于原位杂交及物理作图。Hutchinson等尝试采用减数分裂不同时期的花粉母细胞的染色体用于原位杂交,取得较好的效果。Albini等在黑麦粗线期染色体上成功地进行了重复序列的定位研究。Zhong等建立了适用于FISH(fluorescenceinsituhybridization)技术的番茄粗线期染色体的制片技术,并进行了DNA单一序列的定位研究,其分辨率水平能够达到100kb。1.2抗虫基因准确的染色体近年来,在DNA纤维(extendedDNAfibre)上进行原位杂交技术,已将分辨率水平提高到与常规分子生物技术SouthernBlot分析相当的水平,在1Mb的范围内,FISH定位的分辨率能达到1~3kb。该技术首先在人类细胞中获得成功。其基本原理是,首先将单细胞悬浮液涂在载片上,然后用碱性变性剂将染色体的结构破坏,让DNA分子与复合的蛋白质分离而形成游离的DNA纤维,在这种纤维上进行原位杂交。利用这一项技术,可以展开YAC、BAC、黏粒、噬菌体和质粒DNA克隆在DNA纤维上的线性排列顺序并准确地构建出DNA物理图谱。Fransz等成功地将该项技术引入植物细胞遗传学研究,并在马铃薯上进行重复序列的定位。之后,在番茄DNA上进行了端粒重复序列的染色体定位和DNA分子排列,并已成功地进行了抗虫基因准确的染色体定位。Jackson等人1998年则应用该技术成功地对拟南芥第二染色体上的两邻近重叠群(adjacentcontig)的距离进行了估算,并认为该项技术可用来确定分子重叠群图谱上间隙的实际距离,利于重叠群的组装。2针灸和符号法的发展2.1交位置杂交的原位杂交技术最初,人们普遍采用将含有放射性同位素的核苷酸掺入探针中,杂交后,再通过放射自显影技术显示杂交位置的原位杂交技术分析原核生物的DNA序列组织。同样,该方法也应用到高等植物的研究中,对植物中高度重复序列、rRNA基因、卫星DNA、杂种中异源染色体,许多方面成功地进行了检测及染色体定位研究。之后,许多学者利用放射性同位素标记对低拷贝和单一序列的DNA定位取得了成功。2.2dna探针检测1975年,Manning等人最先在溶液的分子杂交中,使用非放射性标记,通过细胞色素C将生物素(biotin)与RNA分子连接起来。Rudkin等通过制备抗DNA、RNA复合物的抗体检测杂交后的RNA探针,最早进行免疫荧光法结合抗体,显示RNA杂交位点。1982年Langer等人将耦联有生物素的核苷酸(biotin-11-dUTP)通过切口平移掺入DNA探针进行染色体原位杂交,从而开创了非放射性原位杂交时期。根据标记和检测特点的不同可将非放射性原位杂交分为直接法和间接法两种。2.2.1光原位杂交正如同位素法标记探针一样,这类方法是指掺入到探针中的标记物在杂交后可被直接检测到。这种标记物大多为在激发光下能发荧光的物质,故也叫荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybrisizationFISH)。其常用的标记物有异硫氰酸荧光素(FITC)、氨甲基香豆素醋酸酯(AMCA)和罗达明衍生物(TRITC)等。这些标记物掺入到探针中后可用荧光显微镜直接观察杂交结果。如用不同颜色的荧光素标记不同的探针可同时定位两种以上的靶序列,快速、准确、颜色对比鲜明。但与间接法相比,其灵敏度相对较低,并很快为间接法所替代。2.2.2荧光标记检测所谓间接法原位杂交,是指掺入到探针中的标记物不能被直接观察到,必须通过耦联复合物专一地结合到杂交后的探针标记物上,通过特殊的检测方法,来显示杂交位点。这种方法最常用的标记物是生物素(biotin)和地高辛(DIG)。生物素也叫维生素H,最初是从蛋清中发现的,也是最先使用的非放射性标记物。Biotin-16-dUTP、Biotin-11-dUTP、Biotin-14-dATP和Biotin-7-dATP等探针标记物均非常成功地应用到原位杂交研究中。但其杂交位点的检测方法有两大类,一类为免疫学酶促检测法,另一类为显色检测法。常用的免疫学酶促检测方法有两种,一种为辣根过氧化物酶(horseradishperoxidaseHRP)检测体系:以DAB(四氧氯化二氨基联苯胺)/H2O2(双氧水)为底物,反应显示为棕色,或以4-氯-1-萘酚/H2O2为底物,结果则为蓝色。Pennina等较早地采用该检测体系,实现了在果蝇多线染色体上的基因定位,之后该体系在植物原位杂交研究中也逐渐得到应用和发展,并取得满意的效果。另一种为碱性磷酸酶(alkalinephosphataseAKP)检测体系:以BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐/氮蓝四唑)为底物,结果为蓝紫色沉淀。在AKP和HRP两种检测系统之间,前者灵敏度和分辩率较高,但价格昂贵且稳定性不如后者,后者灵敏度和分辩率虽不如前者,但价廉且较稳定。探针标记的信号经抗原-抗体反应,可以将信号级联放大,从而解决灵敏度和分辩率等问题,因此HRP体系得到很快应用和发展。荧光检测系统是将荧光素连接在抗体上,通过对生物素的抗原抗体级联放大,用荧光显微镜观察将非常容易地检测到标记位点。由于不同荧光素在紫外线下显示不同颜色,可以实现同时标记多个探针,同时检测和定位多个位点。尽管生物素标记体系在原位杂交中得到充分的应用,但存在两个缺点:在原核和真核生物中普遍存在着内源性生物素的干扰;抗生物素蛋白对非流动性基质存在非特异性结合,提高标记本底,降低灵敏度。而另一类标记物地高辛是80年代才发展起来的的一种新型非放射性标记技术,由于它具有较高的灵敏度,也克服了放射性同位素标记技术上所固有的缺陷以及生物素系统的不足之处,加上本身方法的不断改进,目前已得到广泛的应用。地高辛又称羟基洋地黄苷毒素,商品名叫Digoxigenin,简称DIG。属于类固醇抗原物质,其抗体与其他任何固醇类似物无交叉反应。常用标记物为digoxigenin-11-dUTP标记物,并且生物素标记系统中的所有标记方法和检测方法都可应用到DIG标记系统中,该标记系统已在植物的基因定位、基因作图、基因表达、基因组进化、发育生物学、远缘杂种以及体细胞杂种分析等研究中得广泛的应用[10,20,27,28,53,54]。3原始频繁技术的开发与应用3.1多核杂交态分析技术的应用为了提高基因物理定位的精确度,人们将染色体显带技术与原位杂交技术相结合。Hutchinson和Seal首次将重复的DNA序列定位在黑麦染色体C带上,但是其效果不理想。Nelson等创建了原位杂交显带技术(insituhybridizationbanding),利用染色体上短散布重复序列(SINES)的一种AluDNA基因家族作为探针与染色体标本杂交,结果得到了类似于R带的带型。期望将目的基因探针与染色体上SINES探针同时应用不同颜色的荧光标记,同时显示出杂交信号和染色体带型,以此来排除杂交与显带之间的相互影响。此后非常成功地发展了同时检测原位杂交信号和高分辩率R带的技术。Jiang等采用修改的N-带和C-带技术将显带后的染色体进行原位杂交,取得了令人满意的结果,应用该方法把多拷贝的DNA序列和外源DNA片段插入点定位在经过显带的小麦染色体上。Cuadrado等克服了C显带技术与原位杂交之间的影响,成功地鉴定小麦中黑麦基因的遗传渗透。Doudrick等对松树同时进行了Q带的核型鉴定与rDNA基因的定位分析。G显带是染色体分析中最常用的技术,已建立了同时获得较理想的G带结果和良好的探针杂交效果。Song等采用原位杂交和G-显带相结合将RFLP单拷贝标记定位在G带的玉米染色体上。3.2利用组织细胞技术准确定位植物基因组1987年,Landegent等创建了染色体原位抑制杂交技术(chromosomeinsitusuppression,CISS)。由抑制杂交进一步衍生出来的基因组原位杂交(genomeinsituhybridization,GISH)已成为植物分子细胞遗传学的重要研究手段。用该技术在小麦中定位了外源染色体、染色体片段以及染色体结构变异等。King等用GISH做了近缘种属关系配对和重组的研究。染色体涂色(chromosomepainting)、重合涂色(coincidencepainting)、比较基因组杂交(comparativegenomehybridization)等由CISS发展而来的新技术。3.3原位定位技术尽管传统的原位杂交技术在植物细胞遗传学研究中取得了很大进展,但在稳定检测单一序列中,成功率较低,主要原因为细胞壁碎片和细胞残余以及高度浓缩染色质阻碍了探针与目标位点的结合。目前发展了染色体引物原位DNA合成技术(primedinsituDNAsynthesis,PRINS)和原位PCR技术(PCRinsitu)。这些技术利用寡聚核苷酸引物对细胞残余和浓缩染色质的高渗透性,从而提高原位杂交的效率和检测的灵敏度。前者是由Koch等人1989年建立的DNA原位合成分析技术,将重复序列α-卫星DNA定位到了人类染色体上。其基本方法是在复性温度下,将变性的染色体与末端标记的寡核苷酸引物特异结合,最初是利用探针作为引物,在KlenowDNA聚合酶或TaqDNA聚合酶的催化下,渗入已标记的脱氧核糖核苷酸,进行引物原位延伸,据此检测探针杂交的位置。在人类细胞遗传学研究中,PRINS在重复序列和低拷贝序列的作图、染色体鉴定、非整倍体鉴定、染色体重排和单拷贝基因定位等方面取得了成功。在植物中,应用该技术先后在豆类、谷物类和黑麦草类等植物中成功地进行了rRNA基因的定位。在大豆和大麦两作物的高度重复和低拷贝序列定位研究中,PRINS技术的分辨率与FISH技术相当。原位PCR技术是通过在单细胞或染色体水平上对特定的DNA序列进行原位PCR扩增后,根据带有标记的扩增产物来检测定位。它与PRINS技术极为类似,只是其反应为多次循环。该技术对人类的病理学研究起到很大