木聚糖酶酶活的测定方法

木聚糖酶酶活的测定方法

为了提高纸浆泡沫的性能，降低血浆泡沫药物的消耗，特别是减少漂白过程中产生的有毒污染物，提出了生物酶预处理血浆泡沫（又称生物泡沫）的应用。科学研究业已证明,木聚糖酶是很有应用价值的且已实现工业化生产的辅助漂白用酶之一。酶活是衡量酶生物活性的重要指标,该数据通常由酶供应者提供,但酶活受到酶储存时间、方式等多种因素的影响会有所损失,因此掌握木聚糖酶酶活的测定方法十分必要。现有的文献关于酶活的测定介绍大多笼统,本文系统地介绍木聚糖酶酶活的测定方法、原理及具体操作,供广大应用木聚糖酶的造纸工作者参考。1方法的总结和比较使用分光光度计测定木聚糖酶酶活的方法概括起来有如下3种。1.1标准比较法1.1.1浓度和正比关系根据朗伯-比耳定律,在同等条件下,一定波长光线透过有色溶液,溶液吸光度(A)与浓度(c)成正比关系。因此,在相同条件下,分别配制标准溶液和试样溶液,再在选定的相同波长下,分别测定A标和A样,按照下式计算试样溶液的浓度(c样),即A标/A样=c标/c样c样=c标·A样/A标(1)1.1.2方法1.1.2.木糖溶液的配制3.0mL反应液里含有1.0mL1.0%的木聚糖溶液(缓冲溶液配制,以下同),0.2mL蒸馏水及1.8mL缓冲溶液,50℃反应15min,加入一定量木糖,溶解后加入2mL?DNS,煮沸10min,冷却后定容至10mL?(见表1)。1.1.2.木聚糖酶酶系统的制备3.0mL反应液里含有1.0mL1.0%的木聚糖溶液,0.2mL适当稀释的木聚糖酶酶液及1.8mL缓冲溶液,50℃反应15min,然后加入2mL?DNS,煮沸10min,冷却后定容至10mL(见表2)。1.1.2.木聚糖酶活测定法3.0mL反应液里含有1.0mL1.0%的木聚糖溶液,0.2mL蒸馏水及1.8mL缓冲溶液,温度控制在50℃反应15min,然后加入2mL?DNS,煮沸10min,冷却后定容至10mL(见表2)。分别测定标准溶液及试样溶液550nm处的吸光值,并根据(1)式计算试样溶液中木糖的浓度,然后计算酶活。酶活单位定义为:每min生成1μmol木糖的酶量为1U。计算公式如下:H=D⋅V1⋅Cx/(T⋅V2)(2)Η=D⋅V1⋅Cx/(Τ⋅V2)(2)式中:H—木聚糖酶酶活,U/mL;D—酶液稀释倍数;V1—比色管定容体积,mL;Cx—木糖浓度,μ?moL/mL;T—反应时间,min;V2—酶液体积,mL。1.2木糖标准品的制备试样溶液及参比溶液的配制方法与标准对照法相同(见表2)。将制成的试样溶液分成体积相同的4份,其中一份A1不加入标准样品木糖,另外3份A2、A3、A4中分别加入不同量的标准品木糖,再测定各份试液的吸光度,作出吸光度对木糖浓度增量的工作曲线(见图1),并与横坐标轴相交于(-Cx,0),Cx即为未知试样中木糖的浓度,最后计算酶活(见公式2)。1.3不同方法的配制及测定木糖酶活配制一系列已知浓度(c)的标准木糖溶液(配制方法见表1),选用550nm波长,测定吸光度(A),作A-c曲线。未知试样溶液及参比溶液的配制方法同表2,测定其吸光度,从工作曲线上求出溶液中木糖的浓度,然后计算酶活(见公式2)。比较以上3种方法,标准对照法方便快捷,但结果精确度不高;增量法精确度高,但在每次酶活测定时都需要绘制工作曲线;工作曲线法可以克服标准对照法精度差的缺点,而且特定条件下,工作曲线固定,因此,较其他2种方法而言,工作曲线法较为方便实用。下面着重介绍工作曲线法测定木聚酶酶活时的具体操作方法。2木聚糖酶活性测定：工作曲线法2.1酶浓度与速率的关系由米氏方程可推得在酶促反应中,底物浓度维持不变时,反应速率与酶浓度成正比,这是测定酶活的基本理论之一。因此木聚糖溶液的浓度应保证足够大,以使酶饱和。要注意,木聚糖溶液必须现配,以防长时间放置出现霉变和自然降解等而影响检测。2.2比色测定测定DNS,即3,5-二硝基水杨酸,在酶活的测定中担任显色剂的作用。DNS能与木糖反应生成有色络合物,从而用于比色测定。DNS试剂的配制方法如下。称取10g3,5-二硝基水杨酸溶于水中,全部溶解后,加入20gNaOH、200g酒石酸钠,加入蒸馏水,使总体积至500mL左右,加热溶解后,加2g苯酚、0.5g无水亚硫酸钠,加热搅拌至全部溶解,冷却,用水稀释至1000mL,储于棕色瓶中,1周后使用。2.3木糖吸光度太深酶液浓度不宜太高,若反应生成的木糖过多,高浓度木糖-DNS络合物颜色太深,影响分光光度计的测量精确度甚至造成无法测量;另外,木糖吸光度与浓度之间在一定范围内成正比关系,超过这个浓度范围,就会偏离朗伯-比耳定律。实验中以试样透光率50%左右为依据,此时,吸光度在0.3附近。2.4木糖在曲线上的吸光度的测定酶活测定中绘制木糖工作曲线的意义在于得到吸光度与木糖浓度的曲线,然后从曲线中由吸光度直接得到未知试样中木糖的浓度。曲线的斜率除以比色皿的厚度(b)就可得到木糖的这种情况下的摩尔吸光系数(ε)。标准溶液、试样溶液、参比溶液的配制分别参见表1、表2。2.5温度和ph对木聚糖酶活性测定的影响测定木聚糖酶酶活时,酶促反应条件如温度、pH要与木聚糖酶的最适温度和最适pH相一致,如,一种木聚糖酶的最适温度50℃和最适pH7.0,则酶活测定时也采取相同的条件;另外,未知试样溶液酶活测定的具体条件要与制作标准曲线时相一致,如,制作标准曲线时各溶液在540nm处测定吸光度,则未知试样吸光度也应在540nm处测定。2.6其他注意事项2.6.1应严格控制酶和木聚糖溶液的反应时间从内盛反应液的比色管放入恒温水浴中起开始秒表记时,到时间后快速冷却。2.6.2反应溶液与dns试剂的反应时间没有酶与木聚糖的反应时间那样要求严格,通常煮沸10~15min即可。2.6.3用分光光度计测量要注意比色皿放置的位置,使其透光面垂直于光束方向,以减少入射光的反射损失和避免造成光程差。2.6.4指纹、油脂或其他沉积物会影响它们的传输特性因此应注意保持比色皿的光洁。2.6.5反应溶液中的比色管不能直接用电炉加热,建议使用水浴。3曲线法的实际应用3.1酶的起源和特征实验采用法国马塞大学提供的木聚糖酶,其最适温度50℃,最适pH7.0。3.2步骤和结果3.2.1吸光度测定3.0mL反应液中含有1.0mL1.0%的木聚糖溶液,0.2mL稀释了15000倍的木聚糖酶酶液及1.8mL磷酸缓冲溶液(pH7.0),50℃反应15min,然后加入2mL?DNS,煮沸10min,冷却后定容至10mL,测定550nm处试样的吸光