免疫组织化学与荧光原位杂交方法检测乳腺癌中c-erbb-2蛋白表达和her2基因扩增的对比研究

免疫组织化学与荧光原位杂交方法检测乳腺癌中c-erbb-2蛋白表达和her2基因扩增的对比研究

原生代因ha2的蛋白表达产物是一种跨膜糖蛋白（p185），具有酪氨酸激酶活性。这是表皮生长因子受体的成员。它通过细胞之间的信号传达来调节细胞的生长、分化和生长。目前研究表明,在乳腺癌中约有25%-30%的病例有HER2基因的扩增和蛋白的过度表达,HER2阳性乳腺癌患者的复发及转移率高、预后不良,且常规化疗效果不佳,而针对HER2阳性的分子靶向抗体赫赛汀(Herceptin)对乳腺癌有很好的疗效,因此HER2的检测广泛受到临床和病理医师的重视。目前常用的检测方法有IHC和FISH,但由于IHC检测C-cerB-2阳性也并非代表的HER2基因扩增,我们应用IHC和FISH检测乳腺癌中的C-erbB-2蛋白及HER2基因表达状况,分析二者之间一致性及实际应用价值,为乳腺癌的诊断与治疗提供可靠依据。材料和方法1.手术切除标本58例乳腺癌为本院病理科2008年1月-2008年9月的活检和手术切除标本,其中浸润性导管癌54例,浸润性小叶癌4例;所有病例均未行术前新辅助化疗。2.方法2.1常规切片观测标本离体后立即固定于10%的中性福尔马林中,固定时间8-24h,常规脱水包埋,以4μm厚度连续切片3张分别用于HE染色、IHC和FISH检测。2.2微波抗体检测C-erbB-2一抗为即用型单克隆抗体(LabVision产品),MaxVisionTM快速法试剂盒购自迈新生物技术开发有限公司。常规切片、脱蜡入纯水。组织切片放入pH6.0的柠檬酸缓冲液中,微波抗原修复,用PBS(pH7.4)洗片后入3%甲醇H2O210min,充分洗涤后加入一抗4℃冰箱过夜,PBS充分洗片,切片滴加即用型MaxVisionTM试剂,室温孵育15min,洗涤后加DAB显色液后显微镜下观察信号并终止显色,苏木素衬染,脱水、透明、封固。已知阳性切片作阳性对照,PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。2.3玻片的制备GLPHER2/CSP17探针试剂盒(购自北京金菩嘉医疗科技有限公司)。组织切片室温下脱蜡,水化,酸性亚硫酸钠50℃处理,蛋白酶K37℃消化,HCl浸泡,-20℃梯度乙醇中脱水,室温浸入丙酮固定,自然干燥玻片。55℃加热玻片5-10min,变性液中浸泡5min,梯度脱水,将10μl变性后的探针混合物滴于玻片杂交区域。封片后置于预热的湿盒中,42℃保温箱中过夜杂交16h。移去盖玻片,立即将玻片分别置于50%甲酰胺/2×SSC、2×SSC0.1%NP-40/2×SSC溶液中漂洗,70%乙醇浸泡3min后取出玻片,暗处自然干燥,将15μlDAPI复染剂滴加于杂交区域位置,覆以盖玻片。暗处放置20min后在荧光显微镜下观察杂交信号。2.4对结果的评估如下(1)瘤细胞染色体参照美国临床肿瘤协会/美国病理学家学院HER2检测指南评分系统:浸润性肿瘤细胞无着色为阴性(0),瘤细胞呈弱且不完整的胞膜着色或<10%瘤细胞呈较弱的胞膜染色为弱阳性(1+),≥10%瘤细胞有较弱但完整的胞膜着色或≤30%瘤细胞呈强且完整的胞膜着色为阳性(2+),>30%肿瘤细胞呈较强的完整细胞膜染色为强阳性(3+)。(2)her2基因检测在10/40倍物镜下观察信号,选择细胞核大小一致、核的边界完整、DAPI染色均一、细胞核孤立无重叠、绿色着丝粒信号清晰的区域,在100倍物镜下,通过特异的单通道滤光片随机计数30个细胞内信号。正常细胞:单个间期细胞核中红色及绿色信号各2个。HER2基因扩增异常细胞:单个间期细胞核中红色信号大于2个。Ratio值计算:Ratio值=30个细胞核中核中红色信号总数/30个细胞核中绿色信号总数,Ratio<1.8提示该样本无HER2基因扩增;Ratio>2.2提示样本中HER2基因扩增,若两种信号的比值>20或众多信号连接成簇时,可不用计算,即视为基因扩增;Ratio在1.8-2.2之间时,可以选择增加计数细胞至100个,或者重新本次实验来判断最终结果。3.h检测方法应用SPSS13.0统计软件,FISH和ICH检测方法采用kappa一致性检验分析;HER基因扩增与C-erbB-2蛋白表达阴/阳性率比较采用X2检验,P<0.05表示差异有统计学意义。结果1.个图4C-erbB-2蛋白阳性信号位于细胞膜,HER2基因扩增为细胞核内红色信号大于2个(图1-4)。58例乳腺癌中FISH检测出HER2基因扩增17例,占29.3%,IHC检测HER2蛋白有阳性信号者33例,占56.9%,其中阳性2+和3+共22例,占总病例的37.9%,C-erbB-2蛋白检出率明显高于HER2基因扩增。2.her2基因检测结果本组IHC检测C-erbB-2蛋白3+的12例中11例HER2基因扩增阳性,1例无扩增,C-erbB-2蛋白2+者10例,其中5例可见基因扩增,HER2蛋白1+者11例HER2基因扩增仅1例,C-erbB-2蛋白阴性病例共25例均未检测到基因扩增。本组结果显示IHC检测C-erbB-2蛋白与FISH检测HER2基因扩增状态有较高的一致性且具有统计学意义(k=0.681,P=0.000);其中C-erbB-2蛋白阴性和3+病例与HER2基因扩增阴性和阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05);而C-erbB-2蛋白1+和2+病例与HER2基因是否扩增(阴/阳性率比较)差异具有统计学意义(P<0.05)。ihc和fish的比较乳腺癌组织中有无HER2基因扩增和蛋白过度表达,对于判断患者的预后、预测临床疗效以及选择使用赫赛汀生物靶向治疗有重要意义,因此准确检测HER2基因和蛋白状况极为关键。在多种检测手段中,以IHC和FISH应用较多,FISH检测目的物为相对稳定的DNA,检测过程较少受人为因素的影响,判读标准客观,可操作性强,特异性高,是检测HER2基因扩增的金标准,但因价格昂贵,且对实验设备要求高,一般实验室难以开展。而IHC检测物为CerbB-2蛋白,其特异性低于FISH法,但却有较高的敏感性,由于IHC方法固有的特点及制片效果、判读因素使不同医院间的结果差异较大。因此现在较多研究者认为对于IHC检查C-erbB-2蛋白阳性患者均应行FISH复查。本研究将IHC和FISH方法进行对比分析,希望寻找到最合理的复查模式。本组58例乳腺癌中有HER2基因扩增者17例,检出率为29.3%,我们的IHC和FISH实验分别在两个独立实验室完成,在各自实验结束后才进行结果比对,在蛋白表达为0和3+的病例,其与FISH检测结果的符合率分别达到了100%(25/25)和91.7%(11/12),与国内外研究结果一致。在C-erbB-2蛋白3+者12例中仅1例未发现相应的基因扩增,占无扩展病例的2.4%(1/41),在推测本例可能出现IHC结果假阳性时,也不能排除FISH实验中偶尔产生的误差情况。实验表明这两组病例IHC和FISH结果具有较高的一致性和吻合性(k=0.681,P<0.01),因此我们认为只要前期组织处理得当,IHC实验严格质量控制,对于IHC检测C-erbB-2蛋白阴性标本无需再做FISH检测;而IHC检测C-erbB-2蛋白3+病例出现假阳性率极低,出于卫生经济学的观点,一般情况下不必强调增做FISH检查。事实上IHC与FISH实验结果对比主要集中在C-erbB-2蛋白表达1+和2+的病例,我们的这两组病例C-erbB-2蛋白表达与HER2基因扩增阳性率比较差异具有统计学意义(P<0.05),其结果的一致性和吻合性都存在明显的差异,特别是2+病例组的误差达到了50%(5/10),与国内文献报道C-erbB-2蛋白2+病例FISH阳性率为25%-76.19%结果一致。因此我们认为这类病人必须增做FISH检查(尤其是C-erbB-2蛋白表达2+的病例),以