养阴活血方对糖尿病大鼠下丘脑c-fos表达的影响

养阴活血方对糖尿病大鼠下丘脑c-fos表达的影响

c-fos是最初的反应基因。在正常情况下，它显示出低水平的发现，包括细胞生长、分化和信息传输。当神经元受到损伤性刺激时表达明显增加,常用作显示神经元活性的标志物。下丘脑是内脏活动的整合中枢,其神经元为神经内分泌细胞。下丘脑与糖尿病的多饮、多尿、多食及高血糖等关系密切。本实验用c-fos免疫组织化学方法,观察了糖尿病模型大鼠下丘脑神经元c-fos的表达及养阴活血方对表达的影响,为临床上糖尿病的预防和治疗提供一定的理论和实验依据。1材料和方法1.1实验动物和实验中心健康雄性SD大鼠30只,清洁级,体重:188.06±8.26g,由浙江大学动物实验中心提供。合格证号:医动字第220010014号。1.2中药、药房和药物养阴活血方主要由丹参、怀山药、葛根、枸杞子、麦冬、太子参各15g,黄芪30g,红花、当归各12g等组成,全部中药购自浙江省中医院中药房,由浙江中医学院制剂室制备成每1ml含生药量2g,4℃冰箱保存备用。链脲佐菌素(STZ)、DAB显色试剂盒和c-fos免疫组化试剂盒均为Sigma公司产品。1.3方法分如下几方面进行。1.3.1大鼠造模前后stz的灌胃养阴活药注射大鼠适应性饲养1周后,随机分为3组:正常对照组、糖尿病模型组和养阴活血方治疗组,每组各10只。养阴活血方治疗组从造模前1周至造模后4周每日灌胃养阴活血方药10ml/kg1次,其余两组灌服相同剂量的生理盐水。糖尿病模型组和养阴活血方治疗组大鼠按50mg/kg剂量腹腔注射STZ,正常对照组注射相同剂量的枸橼酸钠缓冲液。3天后选择空腹血糖≥16.7mmol/L者为造模成功。1.3.2大鼠脑的体外切片成模4周后,各组大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉后,立即开胸暴露心脏,经心脏先后灌注生理盐水和4%多聚甲醛,完整取出鼠脑,脑标本经4%多聚甲醛固定2天,乙醇梯度脱水、二甲苯透明,石蜡包埋,每个标本20μm连续切片。切片脱蜡、水化后,贴于载玻片。1.3.3兔生物素化抗体按标准ABC免疫组化法操作,一抗为兔抗鼠c-fos抗体(1∶200),阴性对照组不加一抗;二抗为羊抗兔生物素化抗体。DAB显色,常规脱水和透明后,用中性树脂封片。1.3.4大鼠脑片c-fos阳性细胞计数大鼠体内c-fos参照Watson图谱和包新民等的图谱进行核团定位,选取经下丘脑的脑片,隔2张取1张,每只大鼠各取5张切片,每张切片在200倍显微镜下计数两侧下丘脑室旁核和视上核的c-fos阳性细胞数目。以每组动物平均每张切片的阳性细胞数目作为该组动物的阳性细胞数目。1.4统计方法本实验数据采用SPSS10.0进行处理,组间显著性采用t检验。2大鼠模型大鼠c-fos阳性细胞的表达下丘脑室旁核和视上核c-fos阳性神经元表达为核呈棕黄色,神经元的细胞质和突起均不显色,细胞轮廓不清楚。正常对照组大鼠下丘脑室旁核和视上核有少量的c-fos阳性细胞,染色较浅;糖尿病模型组可见大量的c-fos阳性细胞,染色较深;治疗组介于两组之间。各组大鼠阳性细胞数目见表1。3糖尿病中嘴唇神经病理及承担的基础问题c-fos基因产物fos蛋白在对外界刺激到基因转录的整个信息传递中起着核内第三信使的作用。在正常情况下多数神经元有低水平的表达。当神经元受损越重,受外界刺激越大,需整合的胞内信息就越多,c-fos基因的表达就越强。本研究显示:与正常对照组比较,糖尿病模型组下丘脑室旁核和视上核c-fos阳性神经元数目明显增多。所以糖尿病大鼠下丘脑室旁核和视上核神经元存在较严重的损伤。下丘脑是内脏活动的整合中枢,其神经元属神经内分泌细胞,摄食中枢、饱中枢和渴感中枢都在下丘脑,并且还分泌抗利尿激素(ADH)和分泌促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)。ADH控制排尿,CRH通过下丘脑-垂体-肾上腺轴参与血糖的调节。下丘脑神经元的受损就会造成上述功能的紊乱,从而引起水钠代谢紊乱、血糖代谢紊乱等症状,其症状与糖尿病的多饮、多尿、多食及高血糖非常相似。下丘脑与糖尿病的病情的发展及预后有密切的关系。糖尿病的基本病理初期是阴虚为本,燥热为标。中期是气阴两虚为本,湿痰瘀血为标。后期阴阳两虚是糖尿病发展的趋势,湿痰瘀血是合并症的主要原因。本实验选择了枸杞子、黄芪、怀山药、太子参、丹参、葛根、红花等组成的养阴活血方,通过改善微循环来增加下丘脑神经元的血供,防止神经元因缺血缺氧而变性、坏死。现代药理学证实:黄芪中的黄芪多糖和黄芪总黄酮、枸杞子中的活性成分枸杞多糖和丹参中的活性成分丹参多糖均具有较高的清除氧自由基和抗氧化的能力,它们具有减少神经元受氧自由基等损伤性刺激。神经元所受的