异丙酚麻醉过程中小鼠脑内erk12磷酸化的表达变化

异丙酚麻醉过程中小鼠脑内erk12磷酸化的表达变化

全身麻醉是怎么发生的？到目前为止，它仍令人困惑着麻醉学术界。全身麻醉药究竟作用于中枢的哪些部位,通过哪些分子起作用,又是如何发挥作用的,一直是科学界不断追求和探索的问题。既往有学者用Fos作为标记物,曾探讨过氟烷、安氟醚和异氟醚麻醉时中枢发生变化的部位及核团。最近研究发现ERK(细胞外信号调节激酶,extracellularsignalregulatedkinase)1/2在多种应激条件下能快速被激活(磷酸化),且磷酸化的ERK1/2(pERK1/2)可以用免疫细胞化学法在脑切片原位显示出来,因而像Fos一样,已被作为功能形态学的标志物之一。但在全脑观察静脉麻醉剂对ERK1/2活化的影响还未见报道。本实验以pERK1/2作为标记物,采用免疫组织化学方法观察了临床常用静脉全麻药异丙酚对小鼠脑内pERK1/2表达的影响,以筛查全麻药引起中枢变化的部位及核团,为探索全身麻醉的中枢作用靶位提供线索。材料和方法1.动物麻醉前处理雄性BALB/c小鼠24只,8周龄,体重18～22g,由第四军医大学实验动物中心提供。动物购回后在新环境中先适应1周,以减少或去除新奇环境应激对实验结果的可能影响。1周后将动物随机分为4组:麻醉前对照组;异丙酚麻醉5min组;异丙酚麻醉后清醒5min组及异丙酚麻醉后清醒1h组,每组6只。2.方法2.1麻醉产生指标各组小鼠置于透明的麻醉箱中,对照组吸入100%纯氧5min后脱臼处死,其余动物腹腔注射异丙酚100mg/kg后纯氧吸入,以动物翻正反射消失和恢复作为麻醉产生和动物清醒的指标。分别在异丙酚麻醉动物翻正反射消失后5min、翻正反射恢复后5min及翻正反射恢复后1h脱臼处死。2.2全脑冠状位切片各组均在处死动物后立即开胸,经心脏灌流固定。先灌流20ml生理盐水冲洗血液,再灌流预冷的4%多聚甲醛100ml。灌流完毕立刻取脑,放入4%多聚甲醛中后固定6h,30%蔗糖脱水,在冰冻切片机(Leica1900,Germany)上作全脑冠状位切片,片厚40μm,隔5张取1张,在含甲醇800ml/L和双氧水3ml/L的封闭液中封闭30min,以清除内源性过氧化物酶。ABC方法如下:兔抗小鼠pERK1/2抗体(1∶1000,NEB公司)室温孵育脑片24h。经0.01mol/L的PBS漂洗3次后,生物素化的羊抗兔IgG(1∶500,Sigma公司)室温孵育脑片8h。0.01mol/L的PBS漂洗3次,生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物(ABC,1∶500,Sigma公司)室温孵育脑片2h,0.01mol/L的PBS漂洗3次,硫酸镍胺加强DAB呈色。经裱片、脱水、透明和封片后,参照Paxinos小鼠脑片图谱光镜下观察并采像。3.阳性细胞计数在保证各组间各核团计数平面相同的情况下,使用Image-ProPlus6.0分析软件对10×20倍光镜所采集图像进行阳性细胞计数,每个部位记录4～5个平面后取平均值。另取部分脑片,用牛血清白蛋白稀释液替代一抗,作为阴性对照。计量资料以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,通过SPSS11.0对组间均数进行单因素方差分析(onewayANOVA),P<0.05视为有统计学差异。小鼠脑内perk1/2阳性神经元的数量变化在麻醉前对照组,感觉运动皮质、嗅周皮质、梨状皮质、扣带前皮质、海马等均有相当数量的pERK1/2阳性神经元。在视上核及下丘脑室旁核也见到一些染色较淡的神经元(Figs.3,4)。阳性产物位于神经元的胞浆、胞核及突起内。以上结果与本实验室以往观察所见一致。阴性对照未见到染色的细胞。在异丙酚麻醉-清醒过程中,小鼠脑内一些部位和核团pERK1/2阳性神经元的数量发生明显变化。在对照组小鼠脑内一些pERK1/2免疫反应阳性细胞分布较多的部位包括感觉运动皮质、嗅周皮质、梨状皮质、扣带皮质、海马等,阳性细胞数在异丙酚麻醉5min后均较对照组明显减少(在梨状皮质P<0.05,余P<0.01)。清醒5min后,除海马外pERK1/2阳性细胞数均有所回升(与麻醉5min组相比,P<0.05);麻醉清醒1h后除海马外,其余均恢复到对照组水平(与清醒对照组比P>0.05)(Figs.1～4)。另一方面,在对照组中一些pERK1/2无表达或低表达的皮质下核团,如杏仁中央核、终纹床核卵圆亚核、缰外侧核、下丘脑室旁核、视上核、下丘脑腹内侧核腹外侧部和E-W核在异丙酚麻醉5min后pERK1/2阳性细胞数均较对照组明显升高(P<0.01);清醒5min后,杏仁中央核、E-W核、缰外侧核、下丘脑室旁核、视上核、终纹床核均较麻醉时明显回降(P<0.01),且在麻醉清醒1h后均恢复至对照组水平(P>0.05)(Figs.1～4)。麻醉对海马神经元系统的激活作用ERK1/2是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPKs)家族成员之一,为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。它涉及细胞多种生理功能的调节,如在调节细胞增殖和突触活动等方面发挥作用,在多种疾病的发病机制和病理生理过程以及行为反应和认知(如学习、记忆)等方面都也起着关键的作用。当其被激活而磷酸化时,可以作用于其它信号通路或胞浆底物,也可从胞浆进入胞核,诱导基因的转录。Khan等观察到反复短暂的氟烷吸入可快速增加下丘脑室旁核的pERK1/2水平。另有离体研究证实异丙酚能显著地抑制小鼠海马脑片ERK1/2磷酸化水平。这些结果都表明ERK磷酸化与全麻药之间有着密切的关系,但尚无在整体动物全脑观察异丙酚影响pERK1/2表达的报道。本研究就这一问题进行了研究,发现异丙酚麻醉后感觉运动皮质、梨状皮质、扣带皮质、嗅皮质等pERK1/2阳性细胞数明显减少,推测可能与全麻药引起的感觉、运动和内脏功能抑制有关。海马接受各种形式的感觉传入冲动,发出的纤维广泛投射到新皮质和脑干中枢。已有研究表明,麻醉期间整个中枢神经系统的抑制状态与全麻药对海马神经元的作用有重要的关联,全麻药物引起的意识丧失和记忆缺失肯定涉及到对海马和皮层回路的抑制作用。本研究发现麻醉后pERK1/2阳性细胞在海马区域明显减少,且清醒1h仍未恢复,可能与麻醉及苏醒期意识丧失和记忆缺失有密切关系,可能是全麻药直接抑制了海马神经元活动或者阻滞了感觉信息向海马的传递。另外,本研究发现杏仁中央核、下丘脑室旁核、视上核、终纹床核卵圆亚核、下丘脑腹内侧核腹外侧部、缰外侧核和E-W核在麻醉后pERK1/2阳性细胞数均明显增多,提示全麻药激活了这些部位的功能活动。杏仁中央核接受GABA能神经元的纤维投射,麻醉下此核的激活可能与睡眠调节有关。下丘脑腹内侧核的激活可能参与全身麻醉抑制伤害性刺激的逃避反射以及控制恐惧焦虑等应激反应的产生相关。视上核内含有分泌加压素和催产素的细胞,可能与全身麻醉对伤害性刺激的抑制有关。下丘脑室旁核内有含促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)的神经元,E-W核是脑内urocortin1的主要表达部位,urocortin和CRF均与应激反应相关。在酒精和乙醚刺激下E-W核也出现Fos表达增强,全麻下这几个核团的激活是否与应激反应调控有关?尚需要进一步研究。终纹床核可能在全麻药抑制伤害性刺激和疼痛调节方面起重要作用。缰外侧核中含GABAA及GABAB受体,接受来自下丘脑外侧及视前区外侧的GABA能纤维投射,并发出纤维投射到中缝核及下丘脑等部位(已知这些部位与睡眠有密切关系),调节整个前脑的单胺能和胆碱能传递。异丙酚作为GABA受体激动剂,其麻醉作用对缰外侧核的激活可能与睡眠、记忆、认知有密切的关系。此外,研究表明刺激中枢神经系统内的一些