河北省张家口市马铃薯线虫形态及分子鉴定

河北省张家口市马铃薯线虫形态及分子鉴定

采用指定的甘薯腐烂茎线（指定的甘薯腐烂茎线），对中国甘薯生产产生了主要影响。王金成、万飞、张淑玲比较了从中国挑选来的甘薯腐烂茎线的系统序列，并发现集群内存在差异。根据其所在地序列的长度，可分为a、b组或s、l组。感染甘薯的主要成分是a或s组，其分区缺乏188bp，但也有b组和外国报告的甘薯腐烂茎线一致的b组。近年来发现马铃薯腐烂茎线虫在我国也危害马铃薯,从我国河北张北县马铃薯上首次发现的马铃薯腐烂茎线虫为B或L类群。最近,作者从河北张家口地区的马铃薯上再次发现线虫危害,为此,本研究对分离到的线虫进行了形态和分子鉴定。1材料和方法1.1de-chabiii马铃薯供试线虫分离自河北张家口市察北区马铃薯薯块,编号为De-Chabei,马铃薯品种为‘大西洋’;以及本实验室从北京大兴区甘薯上分离纯化获得的甘薯茎线虫种群(De-DX)。1.2dna有效分子OlympusBX51显微镜及配套测量软件DP2-BSW系统,FermentasGenomicDNAPurificationKit,TaKaRapMD18-TVector,TaqDNApolymerase(Tiangen公司)。1.3特征值测量及分析方法线虫的固定脱水方法参照武扬等,封固参照文献。选取雌雄虫各20条用OlympusBX51显微镜及DP2-BSW软件拍照并测量,主要测量特征值L,a,b′,c,V及口针长参照文献。1.4虫体分离收集线虫送检样品中选取病薯9个(样品编号为1～9),切取病部组织,用浅盘法分离、收集线虫。按照Fermentas公司GenomicDNAPurificationKit提取9个线虫样品DNA。1.5引物的合成及标准参照Wendt等的报道,选用通用引物rDNA1:5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′和rDNA2:5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′扩增待鉴定线虫的rDNA-ITS,同时用宛菲等报道的马铃薯茎线虫A型特异性引物DdS1:5′-TCGTAGATCGATGAAGAACGC-3′和DdS2:5′-ATTATCTCGAGTGGGAGCGC-3′及B型特异性引物DdL1:5′-TTGTGTTTGCTGGTGCGCTTGT-3′和DdL2:5′-GAGTGAGAGCGATGTCAACATTG-3′进行验证。引物由Invitrogen公司合成。反应体系:2.5μL10×PCRbuffer,2μLdNTP(2.5mmol/L),引物各0.5μL(10mmol/L),DNA模板1μL,TaqDNApolymerase(2.5U/μL)0.25μL。通用引物扩增条件:94℃3min预变性,32个循环(94℃30s变性,45℃30s退火,72℃延伸90s),72℃10min,4℃∞。B型特异性引物退火温度为47℃,延伸时间与A型特异性引物均为60s,余皆相同。反应结束后取5μL产物加1μL6×Loadingbuffer在1%琼脂糖凝胶上电泳,电泳后观察、照相。1.6阳性克隆测序分别将通用引物扩增产物1000、1200bp左右片段,以及特异性引物250、500bp左右片段回收后连接在pMD18-T载体上,转化大肠杆菌感受态,将阳性克隆送Invitrogen公司测序。2结果与分析2.1病斑的组织形态症状描述:受害马铃薯表皮初常见斑点状,中部可见到小孔,后呈现圆形或近圆形疮疤,病斑凹陷于薯块表面(图1a)。切除病部表皮,病部组织中部有干的白色物,其周围组织变褐、变干,最外周组织变软呈水渍状(图1b)。病斑由外而内常呈漏斗状,深约1cm。这与刘先宝等人报道的马铃薯被害状基本一致。2.2刘维志等人鉴定的结果通过测量比较表明,侵染马铃薯的De-Chabei线虫群体与北京大兴区侵染甘薯的群体De-DX形态特征值一致,也与刘维志等人鉴定的结果一致。De-Chabei线虫群体与Thorne、Goodey、Brzeski等人的报道基本一致,但b′值与Thorne报道的有一定差别,因此从张家口市察北区马铃薯上分离的线虫初步确定为马铃薯腐烂茎线虫(DitylenchusdestructorThorne)。2.3de-chabiii种群片段大小及来源分析通用引物rDNA1/rDNA2扩增De-DX及De-Chabei线虫群体9个样品,获得的De-DX线虫样品片段约为1000bp,而De-Chabei种群片段大小约为1200bp(图片未列出),表明De-Chabei线虫群体在ITS区与De-DX群体存在差异。用甘薯茎线虫A型特异性引物DdS/DdS2及B型特异性引物DdL1/DdL2验证De-Chabei线虫群体9个样品,只有B型特异性引物扩增出约500bp单一稳定条带,表明从马铃薯上分离到的9个线虫样品为B型或L型马铃薯茎线虫。2.4整株危害马铃薯fj95将两个群体rDNA1/rDNA2扩增产物及A、B型特异性引物扩增产物回收测序,De-DX序列长度为940bp,De-Chabei产物长1130bp,将后者序列提交NCBI,登录号为FJ911551,ITS序列与已报道的河北张北县危害马铃薯的种群Des-1(NCBI序列号:EF062572)ITS序列相似性达99%,比对De-Chabei种群与A型马铃薯茎线虫的ITS序列中发现其在282～470bp间插入了188bp片段,采用B型特异性引物扩增获得了485bp的特异片段,进一步表明从河北张家口市察北区马铃薯上分离到的线虫为B型或L型马铃薯腐烂茎线虫(D.destructor)。3下一步研究本研究结合形态学与分子生物学技术对河北张家口市察北区侵染马铃薯的线虫进行了鉴定,结果表明为B型或L型马铃薯腐烂茎线虫(DitylenchusdestructorThorne),再次证明马铃薯腐烂茎线虫在河北马铃薯主产区有分布和危害,其在我国马铃薯其他产区及品种上是否有分布和危害还有待于取样调查,值得高度警惕和重视。已报道的B型或L型马铃薯腐烂茎线虫分布在江苏、山