拟南芥和烟草对甲醛胁迫的fir分析

拟南芥和烟草对甲醛胁迫的fir分析

甲醛代谢途径甲醇是植物碳轨迹的重要中间产物。通过处理5、10-亚甲基四羟基苯甲酸、氧化反应和脱甲基环酸反应产生的甲醛。高等植物都有代谢外源甲醛的能力,Giese等发现挂兰(ChlorophtumcomosumL)的嫩芽置于7.1μL·L-1(8.5mg·m-3)14C标记的气体甲醛中超过24h后,回收的放射性中大约88%和植物结合,并被整合进入有机酸、氨基酸、游离的糖分、脂质和细胞壁成分中。据推测植物中甲醛的代谢可能通过一碳(C1)代谢网络进行,代谢途径可能是:(1)甲醛(HCHO)被吸收进植物体后可能会与四氢叶酸(Tetrahydrofolate,THF)形成加合物5,10-亚甲基-四氢叶酸(5,10-CH2-THF),然后由丝氨酸羟甲基转移酶催化参与丝氨酸的合成,或通过其他代谢途径参与泛酸或胸腺嘧啶的合成;(2)5,10-CH2-THF可能也会经由5,10-亚甲基-四氢叶酸脱氢酶/5,10甲川-四氢叶酸环化水解酶(5,10-Methylene-THFdehydrogenase/5,10-Methenyl-THFcyclohydrolase,MTD/MTC)和10-甲酰-四氢叶酸脱甲基酶的作用形成甲酸(HCOOH)。(3)5,10-CH2-THF可能也会经由5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶被转化为5-甲基-四氢叶酸(5-CH3-THF),参与甲硫氨酸或腺嘌呤的合成。(4)HCHO也可能会和谷胱甘肽形成加合物-羟甲基谷胱甘肽,然后由谷胱甘肽依赖型的甲醛脱氢酶催化形成甲酰基谷胱甘肽,再被S-甲酰谷胱甘肽水解酶水解为HCOOH。HCOOH最后被甲酸脱氢酶氧化为CO2和H2O,CO2又通过开尔文循环同化为各种糖类化合物,用这些糖类化合物可合成细胞的各种结构成分如淀粉、细胞壁中的纤维素等。(5)HCOOH也可能会由10-甲酰-四氢叶酸合成酶和MTD/MTC催化的可逆反应转化为5,10-CH2-THF,然后参与丝氨酸或泛酸或胸腺嘧啶的合成。(6)通过(1)～(5)途径产生的氨基酸如丝氨酸和甲硫氨酸等可用于蛋白质的合成。另外通过这几条途径合成的嘌呤和嘧啶可用于核酸的合成。以上的几种甲醛代谢途径在不同植物中的作用可能不同,它们起作用的时间顺序可能也不一样。拟南芥和烟草是植物学研究领域广泛应用的模式材料,对二者甲醛代谢机理的研究可以为探索其他高等植物甲醛代谢提供理论参考。本研究运用FTIR技术分析拟南芥和烟草在甲醛胁迫条件下体内全部物质含量的变化规律及二者的光谱表征,为推定两种植物甲醛代谢终产物和甲醛代谢机理提供重要线索,为证实二者甲醛代谢能力的差异提供证据。1材料和方法1.1烟草和columinia拟南芥(Arabidopsisthaliana,ecotype,columbia)和烟草(Nicotianatabacumcv.Xanth)种子经表面消毒,播种在MS培养基中,长大后用于甲醛吸收和代谢及FTIR分析。1.2方法1.2.1残留甲醛的测定取5g植物材料放入三角瓶中,加入200mL的甲醛处理液(2mmol·L-1HCHO,5mmol·L-1KHCO3和0.1%MES),23℃持续光照振荡培养,处理不同时间后用Nash法测定处理液中残留甲醛的浓度。另取0.4～2.0g植物材料浸泡于10～40mL甲醛处理液(2mmol·L-1HCHO,2μCiH14CHO,5mmol·L-1KHCO3,0.1%MES)中,23℃持续光照振荡培养过夜,用10%三氯乙酸(TCA)抽提并离心得到植物可溶性部分(上清液)和不溶性部分(残渣),不溶性部分连续使用5%TCA洗1次,50%乙醇洗2次,100%乙醇洗1次。用液闪仪测定上清液和残渣的14C同位素活性,并计算出其占起始同位素14C活性的百分比。1.2.2样品预处理和膜制备取5g植物材料放入2mmol·L-1甲醛处理液(200mL)中,23℃持续光照振荡培养。在处理不同时间后取出植物样品,用清水洗去表面残留甲醛,105℃杀青,64℃烘箱干燥24h,磨成粉状200目过筛。置于50℃烘箱中烘至恒重,准确称取1.00mg样本,混入200.00mg碎晶型KBr于玛瑙研钵中充分研磨,全部转移到模具中用压片机制备出均匀、透明锭片。每个处理样本制备3个锭片,于傅里叶变换红外光谱仪上采集谱图。1.2.3样品采集和图谱的采集NicoletFTIR-5700傅里叶变换红外光谱仪,DTGS检测器,扫描范围4000～400cm-1,分辨率为4cm-1,扫描累加32次。每个锭片选取3个点采集3张谱图,取其平均谱图作为最后的样品谱图。应用OMNICE.S.P.5.1智能操作软件进行谱图数据处理。每个样品测定前均对背景进行扫描,得到的红外光谱进行基线校正,确定峰值和吸光度。2结果与讨论2.1对植物甲醛代谢的影响图1(a)显示拟南芥、烟草在2mmol·L-1甲醛处理液中吸收甲醛的速率。拟南芥完全吸收处理液中所有甲醛需36个h,但烟草样品需要处理到48h才检测不到残留甲醛,由此可以看出两种植物均能够吸收处理液中的甲醛,但拟南芥的甲醛吸收能力要强于烟草。用放射性甲醛(H14CHO)处理植物后,在植物的可溶性部分(代谢中间产物)和不溶性部分(代谢终产物)均有14C活性出现,但前者强度仅为后者的1/5(图1(b)),这说明甲醛在植物体内主要被固定成不溶性组分,固定能力的强弱是影响植物甲醛代谢能力的主要因素。拟南芥不溶性部分中回收的14C活性是9.5%,而烟草为6.2%,这表明前者的甲醛固定能力要优于后者。图1(c)显示拟南芥、烟草在2mmol·L-1甲醛处理不同天数后叶片颜色和形态的变化。在甲醛处理后第3天,烟草的叶片上开始出现透明区域或白斑,至第4天,烟草叶片上出现较大面积的透明区和坏死区,但是拟南芥叶片在甲醛处理后的第3天至第4天都没有发生任何可见的变化或损伤。这说明拟南芥叶片对甲醛的抗性比烟草强。2.2甲醛差异的理论依据和线索根据上述结果可推测拟南芥的甲醛代谢能力要强于烟草,但具体机制仍然未知。因此可用FTIR技术研究二者具体的甲醛响应模式,为阐明这种差异提供理论依据和线索。图2为拟南芥和烟草的FTIR图谱,二者光谱特征基本相似,但分别有各自特异的吸收峰,二者主要的光谱特征峰归属如表1所示,其中1376cm-1左右的吸收峰仅出现在拟南芥样品中,而1318cm-1左右的吸收峰仅出现在烟草样品中。2.3拟南基肥中甲醛的代谢图3是拟南芥经2mmol·L-1甲醛处理后红外光谱[图3(a)]及其特征峰强度变化趋势[图3(b)]。甲醛在体内是一种非常活泼的化合物,它本身反应能力极强,能与蛋白质,核酸和脂类等产生非特异性的反应。此外,甲醛的氧化产物甲酰基谷胱甘肽在胞内的过度积累可能导致光氧化过程,严重破坏叶绿体的结构,造成叶片萎黄。在用甲醛处理的拟南芥样品中,所有吸收峰的强度值基本呈现先下降后上升恢复至甲醛处理前水平。在甲醛处理1天时,大量外源甲醛被吸收进细胞内[图1(a)],产生了剧烈的胁迫效应,导致蛋白质、核酸、脂类等生物大分子含量严重下降,红外光谱中所有吸收峰的强度值与对照相比明显降低,处于所有时间点中的最低水平。3,5,7天时,吸收峰的强度值逐渐回升至对照水平,即一系列体内大分子含量恢复到正常水平,这也显示拟南芥细胞代谢活动的正常化。由吸收曲线可知拟南芥在36h即完全吸收处理液中所有甲醛[图1(a)],而此刻胞内甲醛浓度可能没有达到拟南芥所能耐受的阀值,因此在3天时,细胞已经从严重的胁迫中部分恢复,至7天时其代谢活动已经和对照基本一致。与上述变化模式不尽一致的是1376cm-1附近的吸收峰,它是纤维素中甲基的伸缩振动吸收峰,仅出现在拟南芥中。如图3(b)所示,它的强度值在第1天时仅有一个轻微下降,在3天时迅速恢复到对照水平,在5天时继续上升到最高处,7天时回落至对照水平。可推测甲醛处理开始时(第一天),吸收到拟南芥叶片内的大量甲醛应该流向由甲醛氧化到甲酸和CO2的代谢途径(谷胱甘肽依赖途径)。该途径的主要步骤为:甲醛(HCHO)S-羟甲基谷胱甘肽→S-甲酰谷胱甘肽→甲酸(HCOOH)→CO2+H2O。由此途径产生大量的甲酸,大量的甲酸被氧化生成CO2后进入卡尔文循环,用于糖类物质的合成,进而导致纤维素含量上升比其他物质快,所以1376cm-1附近的吸收峰在甲醛处理后第一天下降的趋势不明显。随著处理时间的延长,吸收的甲醛量加大,甲醛通过C1代谢网络流向生成氨基酸到蛋白质或核苷酸到核酸及其他物质的量也逐渐增加,所以后来其他物质的含量也慢慢恢复琢正常水平,这也可能是导致14C同位素示踪实验中从拟南芥回收的不溶性部分有很高的14C活性的原因。依赖于谷胱甘肽的甲醛脱氢酶(FALDH)在植物中有高水平的表达,并对S-羟甲基谷胱甘肽具有高亲和力(Km:1.413μmol·L-1)。S-甲酰谷胱甘肽水解酶活性也已经在植物中检测到,DNA芯片分析证据说明这种酶在植物中的表达水平也较高。Achkor等的研究表明在拟南芥中过量表达FALDH,可以增强转基因拟南芥吸收甲醛的能力和对甲醛的耐性。FALDH表达量的减少降低转基因拟南芥吸收甲醛的能力和对甲醛的耐性。因此目前普遍认为以上2种酶组成的由甲醛氧化到甲酸的代谢途径可能是拟南芥代谢甲醛的主要途径。Ambard-Bretteville等的研究也证实用H13CHO处理马铃薯叶片后,在植物叶片中会有大量的13CO2释放出来。有研究表明在光照条件下,二氧化碳含量显著减少时给水稻喷施甲酸可以观察到外源甲酸被快速吸收,通过甲酸脱氢酶氧化作用快速释放二氧化碳可增加光合碳的可用性。到第5天,1376cm-1附近的吸收峰含量下降,而其他物质的峰仍然上升,这可能是由于该途径中的一些酶基因的表达受甲醛胁迫的抑制,而其他代谢途径上的酶基因表达不受甲醛胁迫的影响,使甲醛的代谢流向该途径迅速减少而向其他途径的流量增加的结果。2.4甲醛对烟草细胞的代谢与拟南芥样品相似,烟草样品中各吸收峰的强度值也在第一天下降,然后缓慢上升(图3)。不同的是,烟草样品吸收峰的强度值最终没有恢复至对照水平,在第4天时再次下降,而此时处理液中烟草叶片出现透明化现象,并开始腐烂。大量甲醛被吸收进入细胞内引起蛋白质、核酸、脂类等大分子含量下降,在1天时所有吸收峰的强度值急剧下降。由于36h后烟草样品中甲醛浓度已经较低,在2天时已经完全检测不到[图1(a)],所以吸收峰的强度在2和3天时有一定程度的回升,回升的幅度没有达到处理前的水平,可能是由于甲醛胁迫对细胞代谢的影响依然持续。甲醛对烟草细胞结构上的损害是不可逆的,且比拟南芥严重,这可能直接反应了二者甲醛代谢能力的差异,这也可能是导致14C同位素示踪实验中烟草不溶性部分回收的放射性活力低于拟南芥的原因[图1(b)]。至第4天时细胞已经大量破碎,导致各吸收峰强度值的迅速下降,这些数据也能反映烟草对甲醛的抗性不如拟南芥强。烟草样品特异性的1318cm-1吸收峰表现出与其他吸收峰一致的变化趋势[图3(d)],这说明甲醛被吸收进烟草细胞后,进入C1代谢网络各代谢途径的流量差别可能不大,因此细胞内各种物质的含量上升的速度是一致的。3烟草甲醛代谢的特性(1)通过甲醛吸收曲线分析和甲醛胁迫后叶片外观形态的变化及14C同位素示踪研究表明,拟南芥的甲醛吸收速率和甲醛抗性及甲醛代谢能力均强于烟草。(2)红外光谱分析表明甲醛胁迫下拟南芥的化学成分没有发生变化,但各化学成分的含量发生改变。拟南芥红外光谱中1376cm-1附近的纤维素甲基伸缩振动峰没有出现在烟草样品中,用甲醛处理拟南芥后它的变化趋势与其他吸收峰不同(在甲醛胁迫开始时仅有一个轻微的下降)。该吸收峰含量的变化趋势可能是拟南芥和烟草甲醛代谢机理差异的主要表征,它反映甲醛胁迫开始时,