生物材料表面的生物相容性

生物材料表面的生物相容性

1表面修饰技术血管移植的生物材料在移植后不可避免地与人体组织或血液接触，导致血液抑制，从而影响材料的愈合效果。因此，这种材料的表面性质对改善生物适应性非常重要。表面修饰是生物医学材料领域的核心技术之一,其根本目的就是要使生物材料表面具有更好的生物相容性。与表面反应相关的参量有很多,如亲水/疏水性、表面能、表面势、官能团、表面电荷、受体位点、分子的运动、粗糙度/质地以及表面分子的空间取向等。表面修饰就是通过改变这些性质来控制生物材料表面的生物反应性质。目前,表面修饰技术已经被广泛应用于心血管植入生物材料的表面改性以提高其生物相容性。除了设计、制备性能优异的新材料外,通过对传统材料进行表面物理、化学和生物改性是一条有效的途径。表面覆膜是应用比较早的一种方法,通过不同的方法在材料表面制备一层无机的或者有机的薄膜,可以起到提高材料血液相容性和抗腐蚀性的作用,如类金钢石薄膜、纤维涂层、碳化硅涂层、Ti-O薄膜等。但是,以上方法仍然摆脱不了远期血栓的形成和并发症的出现。另外,人们还采用了包括表面化学接枝、光接枝、等离子体接枝等技术对生物材料的宏观表面性质进行了修饰,也在不同程度上改良了材料的生物相容性。但是,随着人们对生物材料———表面界面的非特异性作用和生命单元表面行为的不断认识,越来越多的研究者认识到,只有在更微观的尺度上实现对生物材料的表面特异性生物活性作用的精确控制才是从根本上解决生物材料生物相容性的关键。目前,表面接枝生物分子以改善生物相容性的生物方法即是着眼于此。表面接枝生物分子是近些年来发展比较快的一种生物材料表面修饰方法,这种方法首先在物理力学性能适合的材料表面引入官能团,然后通过各种方式引发聚合,建立特定的分子结构,把具有抗凝血或者促内皮化功能的分子接枝到材料表面,以赋予材料优良的血液相容性和细胞相容性。而且所选用的生物分子本身毒性较低,具有较好的生物相容性,通过选择不同的生物分子,如肝素、RGD肽段、VEGF等,可以获得具有抗凝或促内皮化等不同生物学功能的表面,而且还具有表面构建的可控性。2微图形技术的应用目前,心血管植入生物材料表面固定生物分子的方法主要分为物理方法和化学方法两种。物理方法主要包括物理吸附法、静电自组装法、以及微接触印刷术,其中物理吸附法最简单,但其固定的生物分子在体内的释放难以控制,无法保证其长期疗效,目前采用直接物理吸附的方法固定生物分子的研究已经比较少见。静电自组装法制备工艺简单,通过简单的交替浸涂技术可实现材料表面组装分子纳米、亚微米尺度的有规结构设计,能保证生物分子的生物活性,并可在具有复杂体型结构的装置和材料上实现。因此,该技术在生物医用材料领域的研究中得到广泛的应用。微图形技术是一种可控的表面图案化微制作技术,适用于微米、纳米级图形的制作,实现小分子、聚合物、生物大分子,以及细胞在材料表面的选择性吸附或粘附。如Zhang等采用微图形模塑技术在钛(Ti)基生物材料表面制备了PEG-Hep/Fn复合条带状图形,实现图形对血小板粘附和激活的调控行为,有助于进一步了解心血管生物材料表面与血小板的相互作用机制。化学方法中最常用的是共价固定法,主要借助生物大分子上的官能团跟基材表面的功能基团通过化学键合使分子固定于材料表面,提高了固定生物分子的稳定性。但大多数无机材料表面除含有少量羟基外,缺乏并且不易引入足够的功能基团来连接活性分子。现多使用化学/电化学处理,自组装单分子层(self-assemblymonolayer,SAM)和表面等离子体处理等方法来增加已有活性基团(羟基)数量或引入其它活性基团(氨基、羧基等)。而对于高分子材料来说,因其表面存在一些反应官能团,共价固定生物分子要相对容易一些。共价固定提高了生物分子的稳定性,但可能会造成生物活性的损失,但是根据基底材料的不同和所选择生物分子的差异,可以实现保持较高的生物分子的活性。Kishida等在PAA-g-PE表面共价固定了血栓调节蛋白,结果证实血栓调节蛋白可以保持较好的抗凝活性。此外,还有配位结合固定生物分子的方法,如多巴胺中的酚羟基被氧化后,能够通过配位键与金属氧化物(如TiO2等)稳定结合,同时,多巴胺发生自聚合,从而在金属氧化物表面形成结合牢固的聚多巴胺层,聚多巴胺层具有丰富的反应活性基团,为生物活性分子的固定提供了条件。目前,众多研究者已开始结合两种或者几种方法来固定生物分子,在提高生物分子稳定性的同时保证所固定生物分子的活性,这也将是今后关注的重点。3根据不同应用目的的心血管生物材料表面活性剂3.1复合生物分子的作用目前固定生物分子提高植入物血液相容性主要包括固定单一生物分子和复合生物分子(两种或多种生物分子)两个方面。单纯采用物理吸附或者静电作用固定单一生物分子的研究较少,因为采用这两种方法固定的生物分子的稳定性较差。共价固定的生物分子则具有较高的稳定性,但固定生物分子前通常会预先赋予基底表面一定的反应性功能基团。与提高血液相容性相关的生物分子有很多,包括多糖类的肝素、硫化肝素、壳聚糖和与抗凝相关的酶等。肝素具有较好的抗凝性能,是目前临床上常用的抗凝药物,肝素化生物材料被认为是改善血液相容性最传统的方法,但将肝素直接用共价键接枝到材料表面会降低肝素的抗凝血性,因为材料与肝素之间的共价键合抑制了肝素的活性。为保持肝素的活性,可以用一亲水性的“空间臂”如聚氧化乙烯连接材料表面和肝素,从而既提高肝素的稳定性又保持其抗凝活性。藻酸钠是多糖家族的一员,Yoshioka等利用氨丙基三乙氧基硅烷(APTE)将藻酸钠固定在不锈钢表面,发现具有抑制血小板粘附的效果,在改善无机心血管生物材料血液相容性方面具有潜在应用价值。Kishida等将人重组血栓调节蛋白共价固定到PEUU表面,发现经血栓调节蛋白修饰的材料具有更好的抑制血小板粘附和聚集的能力,大大提高了血液相容性。Baker将具有抗凝血性能的磷酸酶(Apyrase),体内实验结果证实这种酶修饰过的表面的血液相容性得到了显著改善。针对以上现象,Nilsson等对Apyrase的抗凝血机制进行了深入的研究,发现Apyrase主要是通过破坏可以导致血小板激活的ADP通路来抑制血小板的激活达到较好的血液相容性。另外,在材料表面形成胶原和明胶涂层后,材料的抗凝血能力也得到了提高。复合生物分子的固定主要包括层层自组装(layerbylayer,LBL)技术和先后/共混生物分子固定技术。如采用聚阳离子聚乙烯基亚胺(PEI)和白蛋白的层层自组装,可在多种材料上形成稳定的白蛋白层,从而形成生物惰性表面。通过LBL技术还可用于构建抗细胞粘附的表面,如海藻酸钠/聚赖氨酸多层膜,可以显著降低材料表面粘附的细胞数,可应用于外科手术后的愈合和防粘连,以及心血管植入材料表面以防止血细胞的粘附。Tan等利用PEI和肝素层层沉积的方法制备了具有抗凝血功能的表面,发现这种表面能够抵抗血小板的粘附并有效延长静态凝固时间,从而为心脏血管装置的表面改性提供了新的方法。另外,聚电解质的种类、组装条件等会影响LBL膜的生物活性,如Houska等制备肝素和白蛋白LBL多层膜,当肝素为最外层时,可显著增加抗凝血因子Ⅲ的粘附;而当白蛋白为最外层时,可有效降低血纤维蛋白原、球蛋白和血小板的粘附。Serizawa研究了在不同盐浓度条件下采用LBL法构建磺化葡聚糖/壳聚糖表面,研究表明膜的厚度随盐浓度升高而增加。只有在盐浓度高于某一临界值时才可能获得凝血/抗凝血交替变化的表面。肝素/壳聚糖的LBL多层膜的动物体内实验证实具有较好的血液相容性。另外,Chen等在Ti表面构建了胶原/肝素多层膜,发现材料的血液相容性也得到了较大的改善。目前,LBL法负载生物活性物质改善生物相容性的研究引起了越来越多学者的关注。先后/共混生物分子的固定主要利用了两种分子之间的共价结合作用或者分子间的特异性识别,然后跟具有反应性官能团的表面结合。采用先后顺序将至少两种生物分子固定在生物材料表面的研究比较多见,Wang等采用EDC交联的方法首先将具有—NH2反应官能团的壳聚糖固定在PLGA表面,然后再将具有—COOH官能团的肝素分子共价固定在壳聚糖上,形成肝素/壳聚糖复合膜,结果显示这种复合膜具有较好的血液相容性。Zhu等利用光化学接枝的方法先将叠氮酸盐标记的壳聚糖固定在PLA表面,随后将肝素成功固定在壳聚糖上,也形成了肝素/壳聚糖复合膜,同样具有较好的抑制血小板粘附和激活的性能。目前,采用共混的方法将两种或者多种生物分子固定在材料表面的研究还相对较少,胡珂等将预先形成的多聚赖氨酸-肝素的纳米颗粒固定多巴胺涂覆的纯钛表面,发现此复合物可以极大地改善材料的血液相容性。Chen等将尿激酶和血栓调节蛋白同时共价固定到磷酸化的PEG表面后,发现修饰后的材料的血液相容性较好,而且这两种生物分子的释放均比较缓慢且活性都能保持得比较好,这有助于改善病人的血栓形成并发症和提高病人的存活率。另外,还有研究者采用静电复合的方法在特定pH值下首先使带负电的肝素和带正电的纤连蛋白分子共混形成复合物,然后再固定到材料表面,以改善材料的抗凝血和促内皮化性能,为心血管植入材料的设计和研发提供理论参考。3.2生物材料的复合方式对表面的修饰作用改善抗凝血乃至血液相容性最理想的途径是在生物材料的表面形成内皮化。但是,直接把内皮细胞种植在材料表面不仅繁殖慢而且还容易从材料表面脱落下来。为了促进材料表面的内皮化,可以在表面固定能促进细胞粘附和增殖的蛋白,如胶原蛋白、层粘连蛋白或多肽(如RGD)。蛋白质和多肽往往具有特定的生物信号,可以显著地改善细胞在材料表面的粘附,但是,蛋白质存在一定的免疫反应和潜在的未知病毒的风险,因此限制了其大规模应用。而多肽却能克服以上缺点并实现对特定细胞的选择性粘附。最近10年间,人们一直利用仿生工程技术致力于少数肽链与生物表面连接的研究。RGD肽是最常见的多肽,能够调节细胞外蛋白质的连接,含有RGD的肽段固定到生物材料表面上具有较好改善内皮细胞相容性的作用。但研究中发现单一生物分子固定并不能达到非常理想的促内皮化效果,而在生物体中各种复杂精巧的功能也是通过生物分子间的协同应用来实现的,因此可以考虑采用两种或者两种以上的生物分子进行复合,然后再对材料表面进行修饰。侯悦等构建了交联的肝素/壳聚糖多层膜,发现该多层膜可显著增加内皮细胞的粘附与生长。Chiu等在三维多孔胶原支架上同时共价固定了内皮细胞生长因子(VEGF)和血管发生蛋白,结果发现同时固定了两种生物分子后的支架较单独固定其中一种分子的支架的表面更能促进内皮细胞增殖和血管发生。因此,鉴于材料与细胞的相互作用是细胞膜表面受体与生物材料所提供的配体之间的相互间分子识别,产生特异性相互作用的过程,因此通过在基质材料上涂覆、组装或共混固定生物分子以提高材料的促内皮化功能是一条可操作之路。另外,表面微图形化也是一种促进内皮化的方法,正常的人体组织是有序化的结构,细胞在体内呈现规则性、有序化的排列,因此,通过微图形技术,在生物材料表面模仿并构筑类似于细胞生长的有序化微环境,是生物材料表面改性的重要技术手段。材料表面细胞图形化分为两种方式:一种是直接改变材料表面形貌如表面的粗糙度、孔洞的大小及分布和取向等,从而影响细胞的位点、细胞外基质的合成与分泌、基因信号因子的表达和识别。研究发现,条纹几何形状的表面有利于内皮细胞的取向和运动;另一种是综合运用物理、化学及微图形制备方法,将促进内皮细胞粘附的生物分子如纤连蛋白、层连蛋白、胶原以及细胞生长因子、合成功能短肽在基底材料上形成图形分布,从而介导内皮细胞在材料表面也成图形分布并促进其在材料表面的粘附、铺展和增殖。Li等采用软刻蚀技术在Ti上制备了透明质酸(HA)微图形,研究了内皮细胞和平滑肌细胞在该图形上共培养的情况,发现内皮细胞比单独培养的具有更好的生物学功能和抗内膜增生功能,该研究为促内皮化的心血管植入装置提供了新的设计理念。3.3确保生物利用炎症反应可能会对医疗器械、假体或移植的生物材料的生物安全性产生影响。因此,在尤为重要的心血管材料的研究中,炎症相容性也是生物相容性各种评价之一,但心血管生物材料领域炎症相容性的研究还相对较少。目前,涉及抗炎症功能的生物分子主要包括多肽类、肝素以及氨基酸聚合物等。Kao等从纤连蛋白中提取RGD和PHSRN多肽,在小鼠体内研究它们在介导炎症反应中的作用,结果证实多肽修饰的材料表面上有较小的炎症反应,RGD和PHSRN在体内介导巨噬细胞行为方面具有时间和方向依赖性。Kim等在Ti表面共价接枝肝素,发现该表面在促进成骨细胞增殖分化的同时也达到了较好的抗炎症效果,说明肝素化的材料表面具有优异的炎症相容性。Li等同样在Ti表面固定了肝素和纤连蛋白的复合物,发现该复合物具有较好的抑制巨噬细胞激活的功能,并可以显著降低IL-1,TNF-α等炎症因子的释放。DeFife等发现在亮氨酸以及赖氨酸上构建的PEA表面培养单核细胞和巨噬细胞24h和7d后,其基质中无论是促炎症因子IL-6或是IL-1β的分泌都相对较少,说明采用氨基酸聚合物具有较好的抗炎症效果。薛旸等研究了聚氨酯和聚四氟乙烯两种血液接触材料与内皮细胞炎症反应的相关机制,证实了炎症反应的发生可能是材料激活单核细胞所致。补体系统是体内的一个重要的宿主防御系统,当植入的导管、支架和心脏瓣膜等与血液接触的时候,补体激活后会引起机体的炎症反应,因此,通过抑制补体激活来减少机体的炎症反应,也是目前材料生物相容性研究中一个重要的方向。Engberg等从链球菌M蛋白中提取M2-N,M4-N和M22-N,通过物理吸附固定在材料表面,对反应基质中的C4BP、C3、C4片段的含量进行了酶免疫测定,结果测得各种片段的含量均有所下降,说明链球菌M蛋白中提取的肽段能结合C4BP,即通过抑制补体激活的经典途径来减少补体激活。另外,Andersson等对表面固定的H因子以及补体激活进行了检测,证实了H因子可通过抑制经典激活途径减少补体激活以抑制炎症发生。4生物功能生物材料众多研究发现,在提高心血管植入物抗凝血性能的同时,往往会损失植入物的内皮化性能,抗凝血和促内皮似乎是一对不可调和的矛盾。但是,近几年也有少数研究发现了通过固定不同生物分子到材料表面而实现二者的协调统一。一般认为,纤粘连蛋白能够增加EC的粘附生长,但也能够促进血小板的粘附,但Hubbell等发现从纤粘连蛋白得到的(Arg-GluAsp-Val)REDV肽共价连接到PET表面时,内皮细胞粘附扩展,而血小板却未粘附;Coombes等将乳酸稳定的白蛋白的纳米微球注入涤纶的编织结构后可促进其内皮化,并且可防止血小板的粘附;Meng等制备了肝素/壳聚糖的多层膜,动物体内实验证实该组装膜具有较好的血液相容性和内皮化性能。Chuang等将HA共价结合到PU表面,发现接枝了低分子量HA的表面不仅可以提高材料的血液相容性,而且可以极大地加速内皮化,而高分子量的HA则不具备这两种功能,说明分子量对生物分子的生物功能具有重要影响。Bos等发现材料上涂布白蛋白和肝素适宜血管内皮细胞生长,若材料上再结合上少量纤连蛋白,会进一步促进血管内皮细胞生长。虽然接上纤连蛋白会减弱肝素抗凝活性,但由于提高了内皮细胞的附着从而更好地改善了血液相容性。目前,针对无机血液接触材料表面内皮化与抗凝双重修饰的研究还较少。由于生物分子种类繁多,将其固定在材料表面所用的引导物质将各不相同,同时不同生物分子对不同材料的反应性也不一致;另一方面,血管内皮细胞作为血管最里面的一层衬里,其腔侧面为带负电荷的细胞膜,吸附到此表面的蛋白质种类繁多,而壁侧面主要是带锚状纤维和小突起的支撑结构,使内皮细胞与基底膜甚至平滑肌细胞形成紧密连接;另外,血小板表面的细胞外衣中包含各种糖蛋白,而膜中又包含了对血小板激活起重要作用的多种酶和受体,因此,各种复杂的构建和作用使得材料表面兼具促内皮/抗凝生物化学修饰的研究任务异常艰巨,还需要解决诸多基本科学问题。此外,还有研究者通过物理(如吸附、共混等)或化学方法(如共价固定)在血管支架表面进行携载药物的研究,包括抗凝血药物(如肝素、水蛭素等)、抗增生药物(如雷帕霉素、紫杉醇等)以及中药提纯物(如姜黄素、大黄素等)等。研究表明,通过携载药物,支架植入临床患者后均不同程度的起到了抗凝、抗炎症、阻止平滑肌细胞增殖、抑制组织增生和防止再狭窄的作用,获得了具有多重生物学功能的表面。如Wang等在PU表面共价固定了水溶性的葡聚糖,研究发现固定了这种生物分子的PU表面不仅可以抑制血小板激活和纤维蛋白原吸附,并且减少了绿脓杆菌的吸附,采用这种生物分子修饰的表面不仅具备了抗凝血的性能,而且具有了抗菌抗炎症的性能;Wang等研究了多层丝素纤维蛋白负载肝素分子的生物相容性,发现肝素分子的释放过程可以显著地抑制平滑肌细胞的增殖和血小板的粘附,并且该载药涂层具有较好的内皮