中奶山羊下丘脑-垂体-卵巢轴催产素分布的观察

中奶山羊下丘脑-垂体-卵巢轴催产素分布的观察

动物的繁殖过程受身体内外因素的综合控制。最重要的调节因素是脑瘫-垂体-性腺轴。换言之，脑瘫通过分泌释放激素或抑制因素调节下肢促性腺激素的分泌。促性腺激素随后通过循环血液循环影响性腺，从而影响性腺的外生殖器和内政部。控制动物的个体发育和繁殖过程。催产素(oxytocin,OT)是下丘脑特殊分化的神经细胞合成的重要生殖激素之一。已有证据显示,除丘脑下部的大多数脑区可合成OT以外,在下丘脑-神经垂体系以外的中枢神经系统的广泛区域内也有OT的分布,甚至在多种动物的卵巢、黄体、睾丸、胸腺等外周器官也存在OT的免疫反应,其中在黄体、睾丸、胸腺还可局部合成。OT除了能参与分娩和泌乳的调节以外,还具有能调节发情周期,促使黄体形成和黄体溶解,扩张血管及促使胃肠道平滑肌收缩等生理作用。为了进一步从形态学角度探讨OT在动物生殖调控中的作用,我们运用免疫组化ABC法对发情周期中奶山羊下丘脑-垂体-卵巢轴上OT免疫反应细胞的分布情况进行了研究。1材料和方法1.1实验动物处于繁殖季节的关中奶山羊母羊8只,临床健康,体重35~45kg。1.2组织固定的方法2只母羊,颈部静脉放血后用4%多聚甲醛灌注固定,采集下丘脑、脑垂体及卵巢,用相同固定液继续后固定24~48h,20%蔗糖液4℃保存,直至组织沉底。另6只母羊,采集新鲜卵巢,生理盐水冲洗,置入4%多聚甲醛,4℃浸渍固定24~72h。1.3免疫组化染色对下丘脑及脑垂体做连续冰冻切片,片厚40μm,隔3取1,取其中3套。第1套进行免疫组化ABC法染色;第2套进行Nissl染色,做核团定位;第3套用于对照。固定好的卵巢沿长轴一分为二,取其中的一半,常规石蜡包埋,连续切片,片厚7~8μm,隔4取1,取3套切片。第1套用于免疫组化ABC法染色;第2套用于HE染色,做OT阳性细胞定位;第3套用于对照,确定本试验反应的特异性。1.4其他抗兔igg(1)切片入0.5%H2O2中作用30min;(2)0.2%TritonX-100浸泡1h(37℃);(3)入一抗兔抗OT血清(1∶3000,新西兰Wapta公司),4℃作用68~72h;(4)1∶500生物素结合的羊抗兔IgG,室温2h;(5)加ABC复合物(1∶500)(ABCKit,美国Sigma公司),室温2h;(6)葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍铵法呈色;(7)切片脱水透明、封片,光镜下观察。以上每步骤间均以0.01mol/LPBS液充分洗涤。对照组用0.01mol/LPBS液代替一抗,其余步骤同上。2疫反应产物的鉴定经免疫组化ABC法染色的切片,背景无色或浅蓝色,OT免疫反应产物为蓝色或蓝黑色,阳性细胞的轮廓清楚,胞质内含蓝黑色或蓝色的反应颗粒,核不着色呈空泡状。对照组切片染色均为阴性,说明免疫组化ABC法具有OT免疫反应的特异性。2.1神经元的分布OT免疫反应阳性神经元呈深浅不等的蓝黑色,为多极或双极神经元,胞体呈不规则的圆形、梭形、三角形等,细胞直径为15~35μm,成堆或分散分布。神经元胞质内充满蓝色的反应颗粒,密集时可融合成团,呈蓝黑色,颗粒稀疏时则可见到圆形的蓝色颗粒;核不着色呈空泡状,居于中央或偏于一侧。多数神经元可见到1~4个突起,较长的突起还有分枝,突起内也有反应颗粒。有的神经元突起伸向第3脑室或血管。还可见到少量免疫反应阳性神经纤维,呈蓝色细丝状或串珠状,颗粒大小不一,形态多样,尤以正中隆起较多(图1A,B)。OT阳性神经元及神经纤维的分布详见表1。2.2阳性神经纤维在垂体前叶未观察到OT免疫阳性反应,仅见到前叶细胞的模糊染色,融合成片,细胞间夹有较多血窦,成空泡状。自垂体柄和正中隆起的一侧可见到平行排列的OT阳性神经纤维,呈断续地延伸至神经部,但进入神经部后阳性纤维变少、变细;典型的纤维内含有大小不等的蓝黑色反应颗粒,膨大成圆形、杆形、梭形等,使纤维成串珠状。由于切面及纤维走向不规则,纤维被切断呈细小点状,有的阳性纤维终末与毛细血管紧贴。在神经部的上部,神经纤维平行排列,到下部纤维交织成网状(图1C)。2.3ot免疫反应细胞在卵巢中的分布2.3.1婴儿和中间卵巢的卵泡及间质未见阳性反应。2.3.2细胞形态及分布本试验所采集的卵巢上一般有2~4个黄体,较大的黄体往往少部分突出于卵巢表面,大部埋于卵巢皮质内。在观察的8例卵巢中,黄体组织中均出现了OT免疫阳性反应。OT阳性细胞根据其胞质内反应颗粒着色的深浅,可分为强阳性、中等阳性和弱阳性3种。强阳性细胞蓝黑色,胞质内的深蓝色颗粒融成一片;弱阳性细胞着色浅淡,细胞轮廓不清,在高倍镜下才可见到胞质内有少量浅蓝色或灰色颗粒;中等阳性细胞胞质着色介于上2种细胞之间,细胞轮廓清楚,胞质内蓝色颗粒呈均匀分布。阳性细胞之间可见到毛细血管及血窦。阳性细胞在形态上以圆形、卵圆形为主,另有相当数量的细胞具有突起。突起呈细长尾样或短而粗,数目1~3个不等。细长的突起往往伸入其他阳性细胞之间,突起内也可见到着色程度不同的反应颗粒。小梁两侧及黄体中央近腔区域的阳性细胞则多呈长梭形。许多阳性细胞未切上核而呈现为蓝色的团块状。圆形及卵圆形细胞直径为13~30μm;长梭形细胞的长轴为21~82μm,短轴为7.8~19μm。从分布上看,强阳性细胞主要分布于黄体周边,少数散布于中央区域,中等阳性及弱阳性细胞则均匀分布于整个黄体组织中(图1D)。连续切片HE染色的对照观察显示,阳性反应主要出现于大黄体细胞,但在黄体被膜下方及小梁两侧等小黄体细胞聚集区域也可见到一定数量的阳性细胞。3讨论3.1外侧区、浚道内核中多核型神经元的分布OT免疫反应阳性神经元在发情周期中奶山羊下丘脑中的分布,以室旁核的数量最多,其次是视上核。另外,在穹窿周核、腹内侧核、腹外侧核、交叉上核、背内侧核、乳头体、下丘脑外侧区、下丘脑前核等也有一定数量的阳性神经元。该观察结果与乏情期奶山羊下丘脑中OT免疫反应神经元的分布相似。由此表明,在发情间期,室旁核和视上核仍然是分泌OT最主要的核团。在第3脑室附近的一些核团,如室旁核、室周核中有一些神经元的突起及神经纤维伸向第3脑室;在室旁核、视上核、穹窿周核等核团可见到OT神经元及纤维环绕血管分布;另外,在正中隆起部位有较密集的神经纤维,而且含有明显的分泌颗粒。这些结果显示,OT可经第3脑室(脑脊液)、血液、神经垂体3条途径释放,通过血液循环作用于靶细胞。3.2神经部延伸本试验仅在垂体的神经部观察到OT阳性神经纤维,并见这些纤维自垂体柄和正中隆起断续地延伸至神经部。由此证明,OT是在下丘脑合成后,经神经细胞轴突的漏斗柄运送至神经垂体的。已有证据显示,在一些高等哺乳动物垂体前叶内,存在数量较多的SP、CGRP等肽能神经纤维,但本试验在奶山羊垂体前叶未发现OT肽能神经纤维。3.3体外细胞he染色研究证实,在发情周期中的绵羊、狒狒、牛等动物的黄体组织中存在OT,并且主要是由大黄体细胞分泌的。但也有学者认为,大、小黄体细胞都能产生OT。本试验运用免疫组化染色,通过阳性细胞大小测定及连续切片HE染色的协助定位,确认大、小黄体细胞都能分泌OT。本试验中所用试验羊卵巢上均有黄体存在,说明所有羊均有发情周期活动,但具体的周期日龄并不清楚。因此,有关OT免疫反应细胞在发情周期黄体期以及在整个发情周期不同阶段的分布变化情况