温度刺激对去卵巢大鼠下丘脑视上核和室旁核c-fos蛋白表达的影响

温度刺激对去卵巢大鼠下丘脑视上核和室旁核c-fos蛋白表达的影响

温度刺激会导致一系列持续和不可加热动物的生理和行为变化。外界环境温度变化可引起恒温动物体温调节反应和渗透压变化等一系列的特殊协调反应。下丘脑视上核(supraopticnucleus,SO)和室旁核(theparaventricularnuclei,PVN)参与温度调节、渗透压调节及一系列协调反应,与动物的渴觉感受及水盐平衡代谢密切相关。SO和PVN内含有多种神经活性物质,如加压素(VP)和缩宫素(OT)。其中,SO以加压素能神经元为主,而PVN以OT能神经元为主。SO和PVN分泌的VP和OT通过下丘脑垂体束进入垂体后叶,释放入血发挥调节作用。当动物进食高盐食物、血钠浓度和血浆渗透压增高时,SO和PVN中与VP分泌有关的神经元就会被激活,神经内分泌增强,血液中VP浓度上升。FOS蛋白作为神经元活动状态的标记物,已被广泛接受并且作为中枢神经系统急性神经激活的神经元形态标记物,是与神经元激活密切相关的核蛋白,已成为定位因急性温度改变而激活的神经元细胞和细胞群的重要方法。因此,通过免疫组化方法检测c-Fos蛋白的表达,可确定细胞的活跃情况。激素缺乏和温度改变与SO和PVN神经元相应变化的内在联系业已得到证实,这将推进更年期症状机制的研究。本研究拟根据四季温度的变化,选取4,10,25,33和38℃5个等级的环境温度,应用cFos免疫组化方法观察去卵巢大鼠下丘脑SO和PVN神经元对不同温度刺激产生的反应,显示核团的温度敏感范围和细胞活跃程度,并推测其是否影响下丘脑的温度调节及其他系统的功能。材料和方法一、材料表面1.实验动物2.主要试剂及仪器二、方法1.去卵巢大鼠模型的建立2.实验分组处理3.切片制备和免疫组化染色4.数据采集三、表达c-fos蛋白表达细胞密度和表达温度的关系数据以均数±标准差表示,采用SPSS14.0统计软件分析结果。对SO和PVN的c-Fos蛋白表达细胞计数采用独立样本t检验;对OVX组和Sham组表达c-Fos蛋白阳性细胞密度在不同温度下相互比较采用单因素方差分析;对温度和手术2种处理因素以及有无交互作用采用双因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。大鼠体质量变化80只实验动物除1只因麻醉过量死亡外,其余都存活,状态良好。OVX组与Sham组相比,术后1～2d体质量稍减小(P<0.05),术后第3天开始恢复。随后大鼠的饮食量明显增加,体质量增加较快,1周左右达到术前体质量,术后2周体质量明显增加(P<0.05)。温度刺激前,安静环境下饲养,自由饮食,切口无红肿,愈合良好。一、大鼠脏器规划Sham组每只大鼠阴道脱落细胞涂片成分不尽相同,但大多为胞质薄、透明蓝染的表层多角形细胞,呈动情周期性变化;OVX组大鼠动情周期性变化消失,阴道细胞呈持续的动情间期表现,细胞涂片成分较单一,细胞小而圆,主要为核大而圆、胞质蓝染的外底层细胞。根据阴道脱落细胞形态判断去卵巢手术是否成功。二、不同温度对让函数的影响棕褐色的Fos免疫阳性物质主要位于下丘脑神经细胞核内。1.同组在不同温度刺激下,下丘脑SO中c-Fos蛋白阳性细胞密度的变化2.同组不同温度刺激下,下丘脑PVNc-Fos蛋白阳性细胞密度的变化so和pvn表达的多态性和复配的能力SO和PVN是下丘脑-垂体-卵巢轴(hypothalamuspituitary-adrenalaxis,HPA)的组成部分及直接控制部位,是整合运动应激反应的活化中枢。SO和PVN是下丘脑中两个与血压、渗透压感受、加压素分泌以及水平衡调节密切相关的核团。一旦异常会直接影响到上述正常的生理功能,这或许是更年期妇女各个系统都易于出现不适症状,乃至疾病的原因之一。因此,研究这两个核团的功能调节具有重要的意义。另外,PVN还参与血管活动的调节,是维持心血管稳定的一个重要调控系统。本研究所观察到的不同温度刺激Sham组SO和PVN核团c-Fos蛋白表达与Bratincsák等和Harikai等的研究结果相似,随着温度刺激强度增强,核团细胞反应活跃且细胞活跃曲线呈现“∨”字型,且热刺激对核团细胞的影响比冷刺激更加明显。本研究发现,同一温度刺激下OVX组SO和PVN中c-Fos蛋白表达的细胞密度与Sham组不同,推测OVX组体温调节以及内分泌功能状态发生了变化。根据不同温度刺激下,相邻温度之间Sham组和OVX组SO和PVN表达c-Fos蛋白强、弱阳性的细胞密度有差异,推测表达c-Fos蛋白强阳性细胞对外界温度刺激的敏感范围:Sham组SO和PVN的敏感范围为低于4℃或高于38℃;OVX组SO的敏感范围为10℃～33℃,PVN的敏感范围为25℃～33℃。推测表达c-Fos蛋白弱阳性细胞对外界温度刺激的敏感范围:Sham组SO的敏感范围为25℃～33℃,PVN的敏感范围为4℃～10℃和25℃～38℃;OVX组SO的敏感范围分别为4℃～10℃和33℃～38℃,PVN的敏感范围为33℃～38℃。由上述结果可见,卵巢切除后性激素减少,OVX组SO表达c-Fos蛋白强阳性细胞和PVN表达c-Fos蛋白强、弱阳性细胞对外界温度刺激可能的敏感范围均较Sham组变窄,PVN敏感范围缩小更为明显,提示性激素缺乏时,因外界温度变化而引发的中枢神经元功能状态变化有别于性激素正常者,且能够随着外界温度变化而进行适应性调节的范围变窄,而OVX组SO表达c-Fos蛋白弱阳性细胞对温度敏感范围稍大,笔者推测这可能是一种代偿机制。OVX组SO和PVN表达c-Fos蛋白阳性细胞密度降低,也提示在性激素缺乏时中枢神经功能状态发生了异常改变。综上,笔者认为下丘脑体温调节中枢温度调定点因缺乏性激素而发生改变,导致机体产热和散热的平衡失协调,引发更年期体温异常波动,发生潮热、出汗等症状。除此之外,SO和PVN表达c-Fos蛋白强阳性细胞交互作用明显,提示手术去势因素和环境温度因素共同影响其体温调节能力。体液的平衡需要精氨酸加压素(argininevasopressin,AVP)来维持。SO神经元的激活导致AVP的合成,其释放入血会引起水钠潴留。最近的研究表明,脱水大鼠糖皮质激素较少是由于SO和PVN大细胞神经元活性降低以及分泌的VP减少。腹腔内注射高渗氯化钠引起急性血浆渗透压增高由大脑的渗透压感受器感受刺激后,兴奋SO和PVN内的大细胞释放VP入血。同时大细胞内c-fos和vp基因的表达增加。有害的刺激会导致c-fosmRNA的表达且增加大细胞神经元内avp基因的表达。渗透压刺激会导致SO内的FOS家族成员的表达。SO神经元接受去甲神经纤维支配而活跃并刺激VP和OT的释放,尤其是在血压和血容量的调节过程中。雌二醇可以调节avp基因的表达以及调节大细胞分泌AVP。此外,AVP神经元的激活可能是通过表达雌激素受体α(ERα)的传入神经元。雌激素水平降低时,由于SO和PVN活跃细胞密度的减少,导致其分泌VP功能也受到影响,这也许是围绝经期妇女血压不稳、胸闷、头晕目眩和心悸等心血管症状的原因。绝经后女性高血压患病率与男性相当,甚至高于男性,可能也与SO和PVN活跃细胞密度减少甚至消失及分泌VP功能障碍有关。本实验研究证实,更年期大鼠与正常大鼠SO和PVN中c-Fos蛋白的表达有差异。这可能是引起更年期妇女情绪烦躁、胸闷、心悸、学习记忆力下降、感觉异常、呼吸急促、消化功能异常、能量代谢以及糖类和脂类代谢异常等常见问题的原因,故有必要对其进一步深入研究,阐述更年期体温调节异常以及其他症状的发生机制,为选择最佳的治疗方式提供理论依据。健康成年清洁级雌性Spraque-Dawley(SD)大鼠80只,购于北京大学医学部实验动物中心,实验动物生产许可证:SCXK(京2006-0008),实验动物使用许可证:SYXK(京2006-0025),体质量210～230g,饲养条件为(25±1)℃,相对湿度40%～50%,自然昼夜比12h︰12h,非直接光照,自由饮食,用不含豆类的特殊饲料喂养2周。兔抗c-Fos多克隆抗体购于美国SantaCruz公司;免疫组化ABC试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司;恒温培养箱购于上海新苗医疗器械制造有限公司,型号SPX-80BS-Ⅱ;切片机型号Leica1900;显微镜OlympusBX51。取上述大鼠40只,1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉后,经腹部正中切口摘除双侧卵巢,建立去卵巢动物模型(OVX组)。其余40只雌性大鼠于腹部相同部位行正中切口,找到双侧卵巢后并不摘除,关闭腹腔,为假手术组(Sham组)。术后大鼠恢复2周。从OVX术后第3天开始,每天检测阴道脱落细胞,连续检查7d,判断去卵巢手术是否成功。将OVX组大鼠利用随机数字表均分为5组,每组8只,分别置入4,10,25,33和38℃5个不同环境温度的恒温恒湿温度培养箱内2h,相对湿度为60%,建立冷热刺激动物模型。Sham组分组及温度刺激条件同OVX组。(1)切片制备。经上述步骤处理后的大鼠,立即用1%戊巴比妥钠(80mg/kg)腹腔麻醉,暴露心脏,剪开右心耳,经左心室插管至升主动脉,先用生理盐水快速冲洗血液,再用含4%多聚甲醛的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersolution,PBS;pH7.4,4℃)固定后立即取脑并置于含4%多聚甲醛的0.1mol/L的PBS4℃后固定4～6h,30%蔗糖的0.1mol/L的PBS内(4℃)至沉底。恒冷箱切片机切取含下丘脑的脑冠状切片,片厚30μm。每只大鼠选取3套切片。(2)免疫组化染色。采用ABC法进行免疫组化染色,主要步骤:(1)第1套脑片0.5%TritonX-100在37℃孵育30min,沸水浴中修复抗原10min。0.3%H2O2室温封闭15min,山羊血清孵育2h。(2)入兔抗c-Fos多克隆抗体(1︰300SantaCruz)室温孵育48h。(3)入生物素化的山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司),室温反应2h。(4)入辣根过氧化物酶标记的卵白素生物素液,室温反应2h。(5)DAB显色,免疫阳性产物为棕褐色。(6)裱片、室温干燥、常规脱水、透明、封片,LeicaBX51镜下观察摄片。每换一种试剂均用PBS漂洗5min×3。阴性对照为第2套切片,用0.1mol/L的PBS代替一抗孵育,其余步骤同上。第3套切片用于Nissl染色,以便定位免疫组化染色的阳性结构区域。切片在光镜(BX51,Olympus,Japan)下观察并应用图像分析仪(Quantimet570c,Leica,German)采集图像。细胞定位参照参考文献,见图1。Fos阳性细胞计数方法:先计数核团内c-Fos强阳性细胞和弱阳性细胞的总数以及核团面积,再算出每个核团单位面积的个数。细胞核深染呈深棕色,轮廓清晰者为强阳性;细胞核呈浅棕色,轮廓清晰者为弱阳性。每组8只大鼠,每只计数5张切片,取其平均值。(1)SO表达c-Fos蛋白强阳性细胞密度在4,10,38℃时OVX组低于Sham组(P<0.01),见表1,图2A～3B,其他温度2组差异均无统计学意义。低于25℃时,Sham组SO表达c-Fos强阳性细胞密度随着刺激温度升高而减小;高于25℃时,则随着刺激温度升高而增大,呈现典型的以25℃为低点的“∨”字型结构。低于25℃时,OVX组SO强阳性细胞密度随着刺激温度升高而减小;高于25℃时,则随着刺激温度升高而增大。SO表达c-Fos蛋白强阳性细胞密度相邻温度间比较结果:Sham相邻温度之间差异均有统计学意义(P<0.01)。OVX组除4℃与10℃,33℃与38℃差异无统计学意义外,其余各相邻温度组间差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),见表2。(2)SO表达c-Fos蛋白弱阳性细胞密度除4℃和38℃OVX组高于Sham组外(P<0.05),其他温度点时2组差异无统计学意义,见表1。Sham组和OVX组弱阳性细胞密度随温度刺激的变化规律与强阳性细胞均类似。表达c-Fos蛋白弱阳性细胞密度相邻温度间比较结果:Sham组只有25℃与33℃之间差异有统计学意义(P<0.01)。OVX组4℃与10℃和33℃与38℃差异有统计学意义(P<0.01),见表2。(3)固定手术去势因素,SO表达c-Fos蛋白强阳性细胞密度在5个温度点,组间差异有统计学意义(P<0.01)。固定温度因素,表达c-Fos蛋白强阳性细胞密度在Sham组与OVX组间差异有统计学意义(P<0.01)。温度因素和手术去势因素有交互作用(P<0.01),见表3。固定手术去势因素,SO表达c-Fos蛋白弱阳性细胞密度在5个温度点,组间差异有统计学意义(P<0.01)。固定温度因素,表达c-Fos蛋白弱阳性细胞密度在Sham组与OVX组间差异无统计学意义。温度差异和手术去势两个因素无交互作用,见表3。(1)PVN表达c-Fos蛋白强阳性细胞密度除25℃两组差异无统计学意义外,其他温度时OVX组均低于Sham组(P<0.05或P<