丝素蛋白的物理和生物相容性

丝素蛋白的物理和生物相容性

丝绸中的丝绸蛋白质是由18种氨基酸组成的天然蛋白质。纯度高，具有许多独特的物理和化学性质，尤其是对生物的良好抵抗力。近年国内外将家蚕丝蛋白用于酶固定化材料、创面保护材料、抗凝血材料、药物控制释放材料、接触眼镜等的研究都很活跃。1重复序列片段和亲水性大侧链的氨基酸蚕丝是由家蚕生产的蛋白质,蚕丝由丝素蛋白和丝胶蛋白组成。家蚕丝素蛋白是由重链(H链)、轻链(L链)及P25糖蛋白组成的复合体。从结构上可以把丝素蛋白看成是天然的嵌段共聚物,由一些小的疏水性氨基酸(甘氨酸、丙氨酸)构成一些重复序列片段和一些亲水性大侧链的氨基酸构成的一些片段组成。这些疏水性片段容易通过氢键和疏水相互作用形成β-片层结构,从而构成蚕丝的高强度力学基础,而亲水以及大侧链部分则构成了较为不规则的部分,赋予蚕丝以较高的弹性和好的韧性。蚕丝通过脱胶、溶解、透析后得到的再生丝素蛋白一般分子量有所减少,几乎只含有丝素H链,是比较纯的蛋白材料。丝素H链一般认为有无轨卷曲、silkⅠ、silkⅡ、silkⅢ4种结构。丝素蛋白在浓溶液中容易形成silkⅠ结构,亲水性较好,所以丝素溶液的浓溶液比较稳定,不易形成沉淀;而在稀溶液中容易形成silkⅡ结构,亲水性较差,反而容易结晶析出形成沉淀。丝素在高湿、高温、应力,或加入糖、乙醇、甲醇、聚乙二醇等其他物质时容易形成silkⅡ结构。2再生丝素材料生物相似性研究蚕丝作为缝合线已经使用了几百年,其生物相容性公认是比较好的,尤其是脱过胶的蚕丝以及再生的丝素蛋白具有很好的生物相容性,目前对于丝素材料的生物相容性又进行了更细致的研究。上海生物材料研究测试中心选择培养23d生长旺盛的L-929小鼠成纤维细胞,采用细胞增殖度试验和溶血试验,对医用丝素蛋白再生膜进行细胞毒性和溶血反应的实验研究。结果表明:该再生膜无明显细胞毒性存在。另外他们还将医用丝素蛋白膜材料按国际标准化组织标准要求制备浸提液,进行急性全身毒性试验、皮肤原发刺激试验、细胞毒性试验,以及Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白mRNA基因表达等试验,综合分析评价其生物相容性,都显示阴性结果。从整体、细胞和分子生物学水平研究提示:医用丝素蛋白膜具有良好的生物相容性。Sugihara研究了蚕丝无纺网植入体内的反应。在植入皮下后,无纺网引起了一个轻微的异物反应而没有形成纤维化,在23种免疫反应表达基因中,仅仅移植禁止因子在很短时间内表现出高的mRNA表达,在植入的6个月内没有明显的淋巴细胞的渗入被观察到。这个结果说明丝素无纺网的良好的生物相容性。再生丝素材料同样具有良好的血液相容性。Sakabe所做的丝素植入体内实验表明,再生丝素材料具有抗血栓性和良好的血液相容性。正常人血的凝血时间分别为:PT11±3s;APTT28±10s;TT16±5s。表1数据表明,杨新林所采集的血液样品的凝血时间在正常范围之内,制备的丝素膜在与血浆接触后,凝血时间变化不大,可见未经过任何处理的丝素膜本身血液相容性良好,基本不会影响血液的凝血过程。3丝素—丝素蛋白的抗原性DavidLKaplan认为脱过胶的丝素纤维对于免疫系统是惰性的,甚至能抑制巨嗜细胞的活性而丝胶则表现出潜在的免疫活性。体外培养骨髓基质细胞(BMSCs)通过研究IL-1βandCOX-2的表达,免疫学证明:丝素反应与胶原相似,细胞体外增殖在丝素上好于胶原,BMSCs细胞在丝素、胶原上相同。组织学观察植入兔肌肉中6星期后,丝素表面反应弱于胶原。SantinY用血浆与丝素接触的研究表明,丝素与体液的相互作用过程中,免疫活性细胞的黏附较少,黏附上去的免疫细胞的活性较低,表明丝素的血液相容性良好,基本不会影响血液的凝血过程。LMeinel也认为丝素蛋白只具有很低的潜在免疫原性。4fpsd的降解蚕丝作为缝合线使用过程中发现,一般在体内1年,丝素纤维丧失大部分的拉伸强力,2年后在移植处无法辨认。由于美国药典关于可吸收(缝合线)生物材料的定义是:“在生物体植入后60d内应失去大部分强度”,所以蚕丝缝合线被FDA归属于不可降解一类。但是,Lam认为丝素是可生物降解的,这是因为丝素对蛋白水解酶敏感。对体外丝素的研究表明:蛋白酶(如糜蛋白酶)将蛋白质的小结晶区转化为缩氨酸,然后缩氨酸被细胞吞噬进一步的降解,糜蛋白酶(由巨噬细胞产生)能降解丝素。李明忠的研究发现,多孔丝素膜可被多种蛋白酶降解。动物实验表明,多孔丝素膜埋植于大鼠皮下3个月内逐步被降解90%以上,6个月时已基本消失。一般地,丝素在体内被缓慢地吸收,吸收的速率与移植点、机械环境、病体的健康和生理特点、种类(生丝或脱胶丝)及丝素纤维直径有关。并且蚕丝处理过程中产生的变体导致蛋白质构象的变化可能使丝素的降解潜在增长或降低,通过调节材料的凝聚态结构可以控制其生物降解速度。5丝素蛋白对表皮细胞生长的影响Minoura1995年发现从绢丝腺中取出的丝素蛋白成膜以后能够支持大鼠L-929细胞的黏附与增值,能够保持细胞功能,与胶原蛋白的实验结果相似。其后KuniyoInouye1998年在丝素膜表面进行成纤维细胞、皮肤表皮细胞的培养结果同样表明,细胞在丝素膜表面的黏附率和增殖速度,与在胶原蛋白膜表面接近。Gotoh后来发现用9~9.5MLiBr溶解家蚕茧壳后所得的再生丝素蛋白膜同样也可以支持细胞的黏附与生长。他们把这种性能归功于丝素膜表面的精氨酸的正电荷以及C-末端非重复序列与细胞表面负电荷的作用。姚敏采用培养液DMEM加5%丝素蛋白溶液,对照组采用培养液DMEM加5%生理盐水的方法,对表皮细胞培养,进行表皮细胞形态、细胞生长曲线、3H-胸腺嘧啶核苷测定等比较观察,结果显示丝素蛋白对表皮细胞生长具有促进作用。Unger考察了一系列细胞包括神经胶质细胞(1321N1),上皮细胞(A549),上皮细胞(CACO-2),角化细胞(HaCaT),内皮细胞(HPMECST1.6R),纤维原细胞(MRC-5),造骨细胞(MG63),上皮细胞(HSTML-12),神经胶质细胞(U373MG)在丝素纳米无纺布上的培养,发现细胞生长情况良好,形态正常。Byung-MooMin在丝素纳米电纺丝上培养人角化细胞NHOK、NHEK、纤维原细胞(NHGF)也表明,细胞的贴壁能力和形态未见明显改变,也未见明显毒性,能支持细胞正常生长,呈现正常的生长繁殖曲线。MasuhiroTsukada在丝素上培养了各种人体细胞,包括细胞SW1116,KB(人口角癌细胞),Colo201(人腺癌),QG56(人肺癌细胞),昆虫细胞Sf9,BmN4,结果发现细胞在丝素和胶原涂层上生长相同,30%~50%高于处理过的聚苯乙烯,只有肿瘤细胞(C181和P087)在3种不同的基质上生长相同。Jin报道丝素纳米无纺网支持人的骨髓间充质细胞的粘附、增值。江莹也证实了脱胶后的丝素具有良好的细胞亲和力,利于骨髓间充质细胞的黏附、生长、增殖。LorenzUebersax采用3种材料:I型胶原、丝素蛋白、聚鸟氨酸,比较胚胎干细胞在其上的培养,结果表明丝素材料上培养的细胞的增值活动较弱而代谢活动较强,丝素可以作为胚胎干细胞的包装材料,用于治疗肌苷缺失症。为了解释丝素蛋白不含有RGD序列而具有良好的细胞黏附能力,Yamada用胰凝乳蛋白酶分解丝素蛋白,采用凝胶层析柱分离得到各种小肽,分析了降解后多肽的生物活性。发现了2种亲水性多肽:VITTDSDGNE和NINDFDED相当于RGD,对人纤维原细胞黏附、生长具有促进作用。6丝素促进ec细胞生长丝素膜表面可以通过接枝上RGD或者其他活性片断来拓宽他的用途,chen发现RGD改性后的丝素蛋白提高了造骨细胞,纤维原细胞和骨髓间充质细胞的黏附、伸展、增殖和分化。同样Kardestuncer研究发现RGD改性后的丝素蛋白提高了对于腱细胞的黏附、增殖,显著增加了腱细胞Col-I的分泌。杨新林采用先在丝素膜上结合RGD的抗体IgG,再将RGD结合到丝素膜表面RGD抗体IgG上,制备成RGD-IgG-SF丝素膜,种植培养血管内皮细胞(EC细胞)于该改性丝素膜的表面,证明改性丝素膜能有效地促进EC细胞的生长。Sofia也指出通过在丝素表面接枝甲状旁腺素(PTH),能够促进造骨细胞在体外的分化。如果使用溶液状态在丝素膜上培养,则能增加细胞的粘附,但是不能促进成骨细胞的分化。最近Karageorgiou发现丝素蛋白膜表面用骨生成蛋白(BMP-2)表面接枝后提高了骨髓间充质细胞向成骨细胞的分化。DavidL.Kaplan分别采用BMP-2接枝、溶液浸泡以及没有BMP-2的丝素膜培养骨髓间充质细胞,检测碱性磷酸酶活性、钙沉积、胶原I分泌、骨沉积,结果发现BMP-2接枝的丝素膜效果比较好。Tsukada,Masuhiro发现在丝素上黏附很多L-929细胞而接枝PEG后黏附很少且没有发现伪足。丝素表面接枝精氨酸,纤维原细胞L-929培养在其上培养,结果发现接枝后降低了丝素表面的黏附性,在丝素上可以观察到丝状伪足,接枝后的没有观察到丝状伪足。YasushiTamada采用氟磺酸吡啶悬浮丝素粉末磺酸化,结果发现丝素表面磺酸化后具有抗凝血性能。杨新林用SO2和NH3等离子体处理丝素膜,发现等离子体处理后,丝素蛋白膜表面分别被磺酸化和氨基化并均能促进人内皮细胞(HUVEC)生长,而且对细胞形态和产生Ⅷ凝血因子的功能没有明显的影响。7丝素蛋白的诱导血管化能力生物材料植入体内要能够形成新的组织或者诱导生成新的组织,血液供应是其关键,没有血供的组织是死的组织。因此,材料的诱导血管化能力是组织修复的关键所在。材料的诱导血管化能力可以通过体外血管内皮细胞的培养和植入体内观察形成血管网的情况来研究。谢菁使用猪髋动脉内皮细胞株在丝素膜表面培养,结果显示,丝素薄膜是对贴壁依赖型内皮细胞的生长具有支持作用的表面材料。R.E.Unger使用人内皮细胞HPMEC-ST1、ISO-HAS-1在丝素无纺布上培养,结果显示丝素无纺布的细胞相容性好,能使内皮细胞黏附、生长、形态正常。杨新林采用小鼠腹主动脉内皮细胞,以丝素、经过SO2低温等离子体技术处理后的丝素、胶原和聚苯乙烯等几种材料为基底,在上面种植血管内皮细胞,研究细胞的生长、增殖、黏附和相关的功能变化情况,结果表明,血管内皮细胞在丝素上的生长情况比胶原蛋白要好。SabineFuchs从人的外周血管中分离得到血管内皮细胞(OECs),在丝素无纺网中培养,通过电子显微镜、荧光免疫检验和基因分析,可以观察到OECs形成了不同的细胞层覆盖在单根丝素纤维上。把这种带细胞的无纺网埋植入血纤维凝胶中发现,OECs从丝素支架上迁移到血纤维形成的血块中并形成了血管样网状结构。这些结果都说明丝素蛋白具有良好的诱导血管化能力。纵上所述,丝素蛋白用于生物材料具有以下优点:(1)安全性:蚕丝是非脊椎动物鳞翅目昆虫分泌到体外的天然高纯度蛋白质,不含细胞器等生物杂质,向人类传播疾病的风险是比较小的。丝素蛋白比较容易从蚕丝中提纯,其具有明确的一级结构,氨基酸排列顺序是已知的,不存在潜在的危害。(2)可设计性:丝素蛋白具有从无规卷曲到丝素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型等4种高级结构,这些高级结构具有不同的物理性能,它们之间相互转化,控制丝素蛋白生成不同的结构及各种结构之间的比例可以得到各种性能的材料。另外丝素蛋白可以很容易制成溶液、丝、膜、水凝胶、三维多孔材料以适应不同的用途。其表面可以通过接枝、涂覆来进行改性处理,也可以通过与其他材料的复合来改善其各种性能。(3)良好的生物相容