电针对慢性情绪应激大鼠下丘脑室旁核crh及其型受体mrna表达的影响

电针对慢性情绪应激大鼠下丘脑室旁核crh及其型受体mrna表达的影响

在现代社会，由各种负面情绪刺激引起的心理疾病（如焦虑障碍等）的发病率日益增加。据美国最新调查显示,在9282例人群中有26.2%的人至少患有一种符合美国精神疾病诊断(DSM-Ⅳ)的精神类疾病,其中焦虑障碍最为普遍且占比例最高(18.1%)。临床研究表明,焦虑障碍患者存在明显的下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴功能异常,且电针治疗焦虑障碍有其独特优势,临床疗效肯定。然而,目前尚未见电针对焦虑障碍HPA轴作用机制的研究报道,故本实验在前期行为学研究的基础上,从HPA轴系统的关键结构之一下丘脑室旁核及其激活的关键环节促肾上腺皮质素释放激素(CRH)出发,通过观察电针对下丘脑室旁核CRH及其Ⅰ型受体mRNA表达的影响,探讨电针治疗焦虑障碍的部分神经内分泌机制。1材料和方法1.1温度保持适应性放养选用SD健康雄性大鼠33只,普通级,体重180~220g。实验室的温度保持在(23±2)℃左右,湿度70%~80%,安静。动物自由进食、饮水,在实验前适应性驯养7d。用SPSS11.5统计软件包完全随机分组程序将大鼠分为3组,即空白组、模型组、电针组,每组11只。1.2图像采集及跟踪分析CRH免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司);CRHR1mRNA原位杂交试剂盒(武汉博士德生物技术公司);Leica4000B图像采集系统及Qwin图像分析软件(德国Leica仪器有限公司);PM-200十字迷宫视频跟踪系统(成都泰盟科技有限公司);G6805-Ⅱ型电针仪(青岛鑫升实业有限公司)。1.3应激刺激的分配采用不可预知的慢性情绪应激(chronicemotionalstress,CES)刺激的造模方法复制焦虑模型。于第8天起除空白组外其它两组动物均接受21d各种不同的应激刺激,包括电击足底(每次持续5s,强度10mA,间隔30s,共20次)、禁水1h(15:00-18:00之间)、禁食1h(15:00-18:00之间)、24h光照、24h黑暗、两笼(每笼3~4只动物)混为1笼、单笼、倾斜、从两笼各抓两只混笼共9种,用SPSS11.5统计软件包将此9种刺激随机分配到21d中,每天安排1种应激刺激。1.4大鼠针刺前培训在造模的同时,电针组进行电针治疗。于每日下午15:00开始固定大鼠,选“百会”“三阴交”穴进行针刺。针刺“三阴交”时,单日取左侧,双日取右侧。针柄接电针仪,选用疏密波,频率15/25Hz,电流1~2mA,刺激强度以大鼠针刺侧下肢轻微抖动为度。每日1次,每次15min,连续治疗21d。空白组和模型组于相同时间进行与电针组相同的固定,不进行针刺治疗。1.5动物的传统外驱力学检测各组大鼠于实验结束后第2天,先进行高架十字迷宫行为学测试。高架十字迷宫装置由呈“十”字型的4个臂区组成,对称分布为开放臂区和闭臂区。实验时将大鼠置于高架十字迷宫中央,运用视频跟踪系统自动监测记录5min内大鼠在开臂停留时间(open-armstime,OT)和进入开臂的次数(open-armsentries,OE)分别占进入两臂区停留总时间和总次数的百分比(OT%和OE%)。动物在开臂停留时间越短(即OT%越小),或进入开臂次数越少(即OE%越小),表示其焦虑程度越大。行为学测试完毕后,各组大鼠立即用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30mg/kg),开胸暴露心脏,眼科剪剪开心尖,将灌注针经左心尖插入主动脉,剪开右心耳,快速注入100ml预热(37℃)生理盐水后,滴注预冷(4℃)的4%多聚甲醛DEPC(diethypyrocarbonate,焦碳酸二乙酯)固定液(DEPC终浓度为0.1%)进行心脏灌注。剥取灌注后的动物脑组织,放入同种固定液中进行后固定,切取含室旁核的下丘脑,常规石蜡包埋,制成6μm切片,每组随机取6只动物相同部位的切片2张进行检测观察。CRH免疫组化检测:切片常规脱蜡至水,3%H2O2灭活内源性酶,5%BSA(牛血清蛋白)室温封闭20min,兔抗CRH抗体(1∶100)37℃孵育1.5h,生物素化羊抗兔IgG37℃孵育20min;链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(streptavidin-biotincomplex,SABC)37℃孵育20min,漂洗后用3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)室温下显色。苏木素轻度复染,脱水,透明,封片,显微镜下观察。CRHR1mRNA原位杂交检测:切片经漂洗、消化、预杂交后,地高辛标记CRHcDNA探针(浓度0.5mg/L)37℃杂交过夜;梯度系列标准柠檬酸盐-氯化钠漂洗后,5%BSA封闭液封闭,滴加生物素化鼠抗地高辛抗体(1∶1000稀释)37℃孵育60min,生物素辣根过氧化物酶复合物37℃孵育20min,DAB显色。苏木素轻度复染,脱水,透明,封片,显微镜下观察。采用Leica4000B图像采集系统采集图像,并用LeicaQwin图像分析软件对每张切片随机选取的5个400倍视野图像进行分析,计算平均吸光度。1.6统计分析方法数值用均数±标准差(ˉx±s)(x¯±s)表示,SPSS11.5统计软件包进行分析。采用单因素方差分析进行多组间比较,方差齐时用LSD检验,方差不齐时用Tamhane’sT2检验。P<0.05为差异有统计学意义的标准。2结果2.1动物的焦虑状态结果见图1。模型组与空白组比较OT%和OE%均明显下降(P<0.01),模型动物呈现明显的焦虑状态,提示本实验造模成功;经电针治疗后,电针组OT%和OE%较模型组有明显升高(P<0.01,P<0.05),而与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05),提示电针有明显降低动物焦虑情绪的作用。2.2脑室旁核小细胞内光镜下观察,CRH免疫组化阳性反应物和CRHR1mRNA原位杂交阳性表达反应物显色均为棕黄色,主要分布于下丘脑室旁核小细胞内(见图2和图3)。比较各组大鼠下丘脑室旁核CRH和CRHR1mRNA平均吸光度值可见,模型组的CRH和CRHR1mRNA表达明显高于空白组(P<0.05,P<0.01),而电针组则明显低于模型组(P<0.05,P<0.01),说明电针具有降低焦虑大鼠下丘脑室旁核CRH及其R1mRNA表达的作用。见表1。3crh及其型受体的作用大量研究表明,当机体受到强烈、持久的刺激时,应激的基本反应为一系列的神经内分泌改变,主要表现为蓝斑-交感-肾上腺髓质系统和HPA轴强烈兴奋,前者参与急性期应激反应的调控,后者参与急性期后慢性应激反应的过程。下丘脑室旁核为HPA轴-神经内分泌轴的中枢控制位点,CRH则是HPA轴激活的关键环节。适量的CRH增多可使机体兴奋或有愉快感;但大量CRH的增加,特别是慢性应激时CRH的持续增加则造成适应机制障碍,从而导致焦虑、抑郁等发生。进一步研究表明,在应激状态下,CRH及CRHR1mRNA表达在下丘脑室旁核等区域均明显增加。在焦虑和抑郁中观察到的应激激素的变化主要由下丘脑神经肽CRH和加压素的高分泌所致,CRH则是通过CRHⅠ型受体发挥其作用,使机体产生焦虑或抑郁样症状。有证据表明,动物呈现焦虑样反应时CRHR1mRNA表达的增强主要与内源性和/或外源性CRH释放增加有关,提示可能与CRH神经元存在CRH自身反馈调节有关。新近的研究表明,CRHR1受体拮抗剂可作为新型抗焦虑和抑郁的神经药理学治疗手段。可见,CRH及其Ⅰ型受体在焦虑发生中有其重要的地位。本研究观察到CES模型组大鼠出现明显的焦虑样行为,且下丘脑室旁核CRH及其Ⅰ型受体表达明显高于空白组,表明CES模型大鼠焦虑行为的发生与HPA轴的激活相关,这与文献报道相似。结果还显示,采用7种不同的应激方式交替作用于SD大鼠21d,造成慢性应激模型,大鼠的活动性降低,探究行为减少和HPA轴亢进,电针“百会”和“印堂”穴可能通过调整垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)、肾上腺皮质酮(CORT)的过度分泌,从而纠正HPA轴亢进,进而改善慢性应激大鼠的行为学表现。电针“百会”“三阴交”穴可降低慢性应激抑郁模型动物血浆COR