发酵工程制药-有机酸类药物的发酵制药

生物制药工艺课程柠檬酸的发酵制药

柠檬酸的发酵1.性质(1)物理性质分子式C6H8O7，又名枸橼酸，为无色半透明晶体，或白色颗粒，或白色结晶性粉末，无臭，虽有强烈酸味但令人愉快，稍有一点后涩味。它在温暖空气中渐渐风化，在潮湿空气中微有潮解性。（2）化学性质酸性与电离

柠檬酸是较强的有机酸，有3个H+可以电离。与酸反应

柠檬酸与发烟硫酸混合，在常温下即产生乌头酸，稍稍加热能生成α-酮戊二酸。柠檬酸与浓硫酸混合，温度在40℃时产生丙酮、CO2、CO等，加热至150℃时生成乌头酸酐；加热至200℃时生成双康酸（C9H10O6）及CO、CO2等。与碱反应柠檬酸与K2CO3或KOH或硝酸共熔得到草酸和醋酸或其它盐类；与钠盐(如NaCl)加石灰干馏得到丙酮。在碱液中煮沸时得到丙烯酸（C3H4O2)。2.柠檬酸的应用（1）在食品工业上的应用

柠檬酸也称第一食用酸味剂，广泛用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂、除腥脱臭剂、螯合剂等。（2）在医药上的应用

柠檬酸盐用于补充相应的元素时，具有溶解度高，酸根直接被吸收代谢而无积留等优点。医药上用的有柠檬酸钠(抗凝血剂)、柠檬酸铁铵(补血剂)等。（3）在化学工业上的应用柠檬酸及其盐类和衍生物在化学工业中广泛用作缓冲剂、催化剂、激活剂、增塑剂、螯合剂、清洗剂、吸附剂、稳定剂、消泡剂等。（4）其他方面的应用3.生物合成途径

柠檬酸合成的途径包括两个生化途径（如图10-1），一个是EMP途径，由糖降解成丙酮酸；另一个是三羧酸循环途径，而柠檬酸就是三羧酸循环中的一个分支。4、代谢调控5、发酵工艺

5.1柠檬酸生产菌青霉、毛霉、木霉、曲霉等。（1）以糖质原料生产柠檬酸的黑曲霉；（2）以石油原料生产柠檬酸的如解脂假丝酵母。

5.2原料薯干、甘蔗渣、废糖蜜、马铃薯、玉米等。5.3工艺柠檬酸发酵工艺的发展可以分为三个阶段：第一阶段(上世纪20年代):青霉和曲霉表面发酵。第二阶段(始于30年代）：曲霉深层发酵的发展。第三阶段（50年代至今）：以黑曲霉深层发酵为主，表面和固体发酵并行。

柠檬酸深层发酵工艺

深层发酵的特点是微生物菌体均匀分散在液相中，利用溶解氧，发酵时不产生分生孢子，全部菌体细胞都参与合成柠檬酸的代谢。其优点如下：(1)发酵体系是均一的液体，传热传质良好，不存在死角。(2)设备占地面积小，生产规模大。(3)发酵速率高,采用预培养菌丝球接种时只需50-70h即发酵完毕。(4)产酸率高，产柠檬酸几乎接近理论产率，菌体生成量少，原材料消耗低。(5)发酵设备密闭，杂菌污染的可能性小，管理方便。(6)完全机械化操作，并可以实现自动控制，劳动强度低，劳动生产率高。(7)发酵副产物少，有利于产品提取，所得产品质量高。

然后用无菌压缩空气将培养的菌丝体（保持在35℃左右）输入发酵罐中。发酵在35℃左右进行，通风搅拌培养4天。当酸度不再上升，残糖降到2g/L以下时，立即将发酵醪泵送到储罐中，并及时提取柠檬酸。操作方法：在种子培养基中添加硫酸铵0.3%～0.5％拌匀，待种子培养基冷至约35℃接入黑曲霉麸曲，于35℃下通风培养20～30h。

柠檬酸的提取

成熟发酵醪中除了含有主要产品柠檬酸之外，还含有残糖、菌体、蛋白质、色素、胶体物质、无机盐和有机杂酸，以及原料带入的各种杂质。这些物质必须采用一系列物理和化学方法进行处理。提取工艺有钙盐法、萃取法、离子交换法和电渗析法等。但目前普遍使用的仍是钙盐加离子交换的提取方法。钙盐法提取工艺流程1.发酵醪预处理

发酵醪成分如下：柠檬酸80％～95％，葡萄糖酸0.2％～0.3％，草酸0.1％～0.3％，残糖0.2％～0.5％。此外还含有蛋白质等胶体物质。在发酵结束之后，应及时将发酵液加热至100℃。热处理的作用：（1）杀死微生物终止发酵，防止柠檬酸被分解（2）使蛋白质等胶体物质变性凝固，降低发酵液粘度，有利于过滤；（3）使菌体内柠檬酸释放出来，提高收率。2.菌丝过滤3.中和4.酸解脱色5.树脂净化

强酸型阳离子交换树脂去除Ca2＋、Fe3＋等金属离子。6.浓缩与结晶

将酸解液置于60℃以下进行减压蒸发，浓缩至70％以上，待结晶。7.干燥

沸腾干燥箱，去除晶体表面的自由水。温度控制在35℃以下，否则会失去一部分结晶水，影响成品光泽。生物制药工艺课程葡萄糖酸的发酵制药葡萄糖酸的发酵生产葡萄糖酸（五羟基己酸）是一种有机弱酸，含4个不对称碳原子，是制药工业和食品工业的重要原料，在建筑、化妆品、纺织、塑料制造上也有应用。20世纪20~30年代，发现某些微生物可以发酵葡萄糖成葡萄糖酸。20世纪50年代，流加氢氧化钠生产葡萄糖酸钠，发酵时间为20h，成为现代深层发酵葡萄糠酸的基础。葡萄糖酸与碳酸钙或石灰中和生成的葡萄糖酸钙，可治疗生理性缺钙症和血钙过低所引起手足抽搐、痉挛等症，以及治疗软骨、佝偻等缺钙症，食品工业中用来制作果酱等。葡萄糖酸水溶液可形成葡萄糖酸δ-内酯和葡萄糖酸γ-内酯，三者等量混合存在。葡萄糖酸δ-内酯是食品添加剂，可作为凝固剂、膨松剂、酸味剂。1．生产菌种曲霉、醋酸菌、多种青霉(尤其是产黄青霉)、几种假单孢菌以及其他几种菌。工业上常用的是醋酸菌和黑曲霉，特别是黑曲霉，在高糖浓度和微酸条件下能迅速氧化葡萄糖成葡萄糖酸，转化率在95％以上。2．发酵工艺液体深层发酵多采用高浓度水解糖（25％~35％）和无机氮源，发酵时间40h。培养基中加入CaCO3，或在发解过程中添加50％的NaOH溶液，使pH值保持在5.5~6.5之间。目前已采用连续发酵法和固定化细胞连续生产葡萄糖酸。斜面菌种→摇瓶种子→种子罐→发酵罐→过滤浓缩→活性碳脱色→阳离子交换树脂脱钠→葡萄糖酸3．提取用离心、过滤或沉淀法分离菌丝体。钙盐清液在搅拌下升温加石灰乳，使钙总浓度达酸浓度的98％，100℃下浓缩到过饱和，冷至20℃静置，葡萄糖酸钙结晶自然析出。或浓缩液用等浓度H2SO4酸化，并过滤除去CaSO4结晶即可得葡萄糖酸溶液。钠盐清液经活性炭脱色和阳离子交换得到葡萄糖酸溶液，浓缩至过饱和后再冷至30℃，可结晶出无水葡萄糖酸。生物制药工艺课程乳酸的发酵制药乳酸医药用途在病房、手术室、实验室等场所中采用乳酸蒸气消毒，可有效杀灭空气中的细菌，起到减少疾病，达到提高健康之目的；在医药方面广泛用作防腐剂、载体剂、助溶剂、药物制剂、pH调节剂等；乳酸聚合得到聚乳酸，聚乳酸可以抽成丝纺成线，这种线是良好的手术缝线，缝口愈合后不用拆线，能自动降解成乳酸被人体吸收，无不良后果。尤其是体内手术缝线，免除二次手术拆线的麻烦。这种高分子化合物可做成粘接剂在器官移植和接骨中应用；乳酸可以直接配制成药物或日常保健品使用；乳酸的性质

乳酸是无色至淡黄色透明、浆状液体，有吸湿性，口味酸涩。乳酸有D-型、L-型和DL-型三种构型，只有L-型乳酸才能被人体完全吸收。L-乳酸为左旋性，D-乳酸为右旋性。分子量90.08。结构式表示如下：乳酸菌是一群能利用碳水化合物（主要为葡萄糖）产生大量乳酸的细菌的统称。保加利亚乳杆菌（乳杆菌属）乳杆菌属链球菌属明串珠菌属片球菌属双歧杆菌属嗜热链球菌（链球菌属）乳酸发酵指糖经无氧酵解而生成乳酸的发酵过程。乳酸代谢同型乳酸发酵：经EMP途径，生成乳酸。异型乳酸发酵：经PK途径，生成乳酸和乙醇。双歧乳酸发酵：经HK途径，生成乳酸和乙酸。乳酸脱氢酶EMP途径葡萄糖葡萄糖-6-磷酸葡萄糖酸-6-磷酸5-磷酸核酮糖5-磷酸木酮糖乙酰磷酸乙酰CoA乙醛乙醇ADPATPNADNADH+H+NADNADH+H+NADNADH+H+ADPATPNADNADNADH+H+NADNADH+H+己糖激酶5-磷酸核酮糖-3-差向异构酶磷酸解酮酶磷酸转乙酰酶乙醛脱氢酶乙醇脱氢酶丙酮酸乳酸脱氢酶PK途径乳酸

2葡萄糖

2葡萄糖-6-磷酸6-磷酸果糖6-磷酸-果糖2木酮糖-5-磷酸磷酸己糖解酮酶磷酸己糖解酮酶4-磷酸-赤藓糖乙酰磷酸2甘油醛-3-磷酸2乙酰磷酸2乳酸2乙酸乙酸HK途径特别提醒：微生物的代谢途径一般都不是单一的，不论同型乳酸发酵还是异型乳酸发酵，实际代谢产物都不象代谢途径中那样单纯，两类乳酸发酵的代谢产物没有不可逾越的界限。应用范围：同型乳酸菌发酵的微生物已经用来发酵产生乳酸。异型乳酸发酵的微生物，例如双歧杆菌，已经用于发酵生产活菌饮料。

乳酸发酵微生物（1）乳酸细菌1）乳酸菌分离酿造发酸食品采样泡菜形式富集碳酸钙透明圈法分离（倾注法倒平板）2）产D-乳酸细菌德氏乳杆菌：77g/L，转化率90%，D-乳酸比例：90%保加利亚乳杆菌：40g/L，转化率72%，D-乳酸比例：99%左旋乳酸芽孢杆菌菊糖芽孢乳杆菌：98g/L，转化率97%，D-乳酸比例：99%3）产L-乳酸细菌乳杆菌、链球菌、芽孢杆菌趋势：嗜热乳酸杆菌，厌氧高温发酵（50℃以上）部分微生物乳酸全部为L型，部分含少量D-乳酸产乳酸细菌较多，根据需要选择个别菌属可产淀粉酶（嗜淀粉乳杆菌）（2）米根霉果园、菜园、花盆土壤中或谷物上分离马丁（Martin）培养基分离纯化最适温度30℃，产酸多，副产物多，对糖利用效率低，但可以以淀粉为原料（分泌淀粉酶、糖化酶）

乳酸生产工艺1原料及预处理碳源1）蔗糖2）糖蜜3）葡萄糖4）淀粉辅料：麦根、麸皮、米糠、玉米浆、毛发水解液2发酵工艺（1）细菌发酵工艺1）菌种（德氏乳杆菌）A）同型乳酸发酵的乳酸菌B）营养要求简单C）耐高酸，反馈抑制作用小D）耐高温，最好在50℃以上2）菌种扩大培养（种量5-10%）菌种成熟指标：乳酸5-7g/L，细胞含量7-8*1010个/ml，镜检可以看到2-4个细胞排列成链，原生质均匀，无大的异染颗粒，无杂菌培养基配方：还原糖15%，麦根3.75%，磷酸氢二铵0.25%，碳酸钙10%种子培养：50℃,24h，接种量1-10%发酵操作：填料系数0.8碳酸钙分批添加，控制pH不低于5.0温度：50℃发酵罐敞口，利于二氧化碳逸出残糖低于1g/L发酵结束周期：5-6d发酵结束，加石灰乳调pH10.0，提温至90℃，澄清后进入提取工段。（2）米根霉发酵工艺斜面孢子：30℃,4d种子培养基：葡萄糖11%，尿素0.2%，KH2PO40.06%，MgSO40.025%，ZnSO40.088%,CaCO31%,pH自然，34℃,24h发酵培养基：葡萄糖15%，尿素0.2%，KH2PO40.02%，MgSO40.025%，ZnSO40.044%,CaCO36.7%(单独灭菌),pH自然，34℃,32-34h发酵结束，氢氧化钙中和至pH7.0，压滤或离心去除菌体3提取工艺发酵液-----预处理（碱化）------提取------粗乳酸-------精制------成品乳酸1）细菌发酵预处理发酵结束，5水合乳酸钙，发酵液变粘，糖浓度高固化发酵结束升温至90-100℃，加入石灰乳，pH调至9.5-10.0，静置4-6h（维持温度55℃），沉渣清液分离活性炭60-70℃脱色，去除色素乳酸钙结晶酸解工艺滤液------浓缩--------冷却结晶-------离心洗涤--------加热溶晶--------酸解（硫酸）----------过滤（去除硫酸钙）----------脱色（活性炭）-------粗乳酸乳酸钙常温下溶解度：5%，水溶液pH6.0—7.0，乳酸钙浓度达11—14波美度可自然结晶1）浓缩：12-13波美度（乳酸钙26—28%）杂质影响（杂质增加1%，乳酸钙溶解度增加10%），浓缩前要除杂乳酸钙结晶酸解工艺2）结晶初始温度30℃----------23℃（1h），投放6—7%晶种23℃-------18℃（1.5h）后温度每1h降低2℃终温10℃，保持3—5h晶核形成：不能搅动或震动，否则会形成粥状结晶，无法和母液分离影响结晶因素：起晶诱导时间、晶核形成速度