发酵工程制药-糖类药物的发酵制药

生物制药工艺课程透明质酸的发酵制药透明质酸可用作眼科人工晶体植入手术的粘弹剂、骨性关节炎和类风湿性关节炎等关节手术的填充剂，作为媒介在滴眼液中广泛应用，还用于预防术后粘连和促进皮肤伤口的愈合。透明质酸与其它药物反应形成的化合物对药物发挥缓释作用，可达到定向和定时释放的目的。随着医药科技的发展，透明质酸在医药方面的应用将越来越广泛。透明质酸是减缓关节炎疼痛的良药医药级透明质酸透明质酸在体内的生理功能已不局限于网状结构及黏弹性等物理机械功能。透明质酸受体的发现对透明质酸的认识有了质的飞跃，揭示了其通过受体的结合，调节细胞的功能从而在胚胎发育，肿瘤发生，组织愈合等方面扮演了重要角色。透明质酸受体的发现还有助于开发新的给药途径。明确掌握透明质酸代谢机制，通过发现其代谢异常，可对一些疾病的诊断和治疗具有指导意义。透明质酸的生理功能项目动物组织提取法发酵法存在状态在原料中与蛋白质和其他粘多糖形成复合体，分离纯化复杂在发酵液中游离存在，易于分离纯化相对分子质量取决与动物组织原料，基本无法控制，一般为（0.1-2.5）*106可通过发酵培养参数条件进行控制，一般为（1.0-4.0）*106品质与产量取决于动物组织原料的品质与数量品质可控，产量无限制成本高低发酵法生产透明质酸的优点主要原料是人的脐带、鸡冠和牛眼玻璃体等。用丙酮或乙醇将原料脱脂、脱水、风干后，用蒸馏水浸泡、过滤，然后以氯化钠水溶液和氯仿溶液处理，之后加入胰蛋白酶保温后得到混合液，最后用离子交换剂进行处理、纯化得到精制的透明质酸，该法提取率极低，仅为1％左右。透明质酸的制备方法利用天然原料即从动物组织中提取以葡萄糖作为碳源，在培养基中发酵48h，发酵结束后，过滤除去菌体和杂质，然后用醇沉淀法等简单操作即得到高纯度的透明质酸。采用发酵法制得的透明质酸，优点是能按商品设计来设定分子量。发酵法的关键在于菌种的选择，目前多选用链球菌属类菌种等。透明质酸的制备方法

生物发酵法兽疫链球菌镜下观察，圆圆的，常见多个细菌连在一起，成链状，故称链球菌。以透明质酸为主要成分的荚膜围绕在菌体周围，保护细菌免受伤害。链球菌正常生长是一个产酸过程，通常做法在稳定期提高发酵液的pH值。结果部分链球菌因pH突然变大而停止生长并产生荚膜，那些继续生长的链球菌会不断产酸，使发酵液pH恢复正常。此时再次提高发酵液pH。如此往复菌体不但能正常生长而且能不断的产生我们所需要的荚膜。但是整个过程中pH值不能调的过高，如果过高，菌体因无法承受而被杀死。透明质酸的发酵生产

一、菌种和培养基链球菌属于兼性厌氧菌，在透明质酸的发酵工艺中，大多数采用有氧发酵。有氧发酵的葡萄糖能量代谢可产生更多的ATP，有利于UTP生成，而UTP是生成透明质酸的两个活化前体物，即UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡糖所必需的物质。因此从代谢调控的角度来说，有氧发酵有利于透明质酸的合成。斜面培养基/％：葡萄糖0.2，牛肉膏1.0，蛋白胨2.0，酵母抽提物0.5，NaCl0.2，Na2HPO4•12H2O0.1，KH2PO40.012，琼脂2.0；pH7.0～7.2。种子培养基/％：同斜面培养基，不加琼脂。发酵培养基/％：蛋白胨2.0，酵母抽提物1.0，MgSO4•7H2O0.1，K2HPO40.25，NaCl0.2；pH7.0～7.2。葡萄糖配成50％的水溶液，单独灭菌。

培养基生产透明质酸用培养液，氮源为蛋白胨，酪蛋白水解液，酵母膏，牛肉膏，大豆蛋白水解液，尿素，无机铵盐等。其中，酵母膏最为常用，除作为氮源外，还含有多种维生素和生长因子，有些是链球菌生长所必需的。在发酵液中添加一定量的谷氨酸和精氨酸，可提高透明质酸的产率。碳源主要是各种单糖，蔗糖和淀粉水解物，最常用的是葡萄糖，要求药品级口服葡萄糖，其他还有磷酸盐，硫酸盐等无机盐。纯化水不含金属离子，溶解物料。氢氧化钠：为中和剂，因为发酵时产酸，导致PH降低，从而减缓反应速率。

斜面种子→摇瓶种子→接种→发酵培养→补料→放罐→发酵液（加乙醇粗提）→粗提液（加助滤剂、活性炭，调pH→过滤（去除杂质）→滤液（乙醇沉淀）→沉淀物（脱水干燥）→成品透明质酸二、工艺流程

工艺流程无菌空气制备设备

三、种子扩大培养摇瓶培养取斜面种子，接种于装有灭菌培养液的三角瓶中，37℃培养12h～16h，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染即可接种到种子罐中。培养液的配方：蛋白胨10g，牛肉膏5g，酵母膏5g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾2g，硫酸锰0.3g，加水溶解至1L，115℃灭菌30min。1、调种子罐压0.05Mpa；调大接种口排污阀门，调小接种口靠罐阀门，使排气口有气排出即可，关闭接种口排污阀门；2、点燃火焰圈，放于接种口下方5cm处；3、在火焰保护下，迅速解开接种口外套，解开软管上包扎用棉绳，迅速将软管套上接种口；4、移走火焰圈，用卡箍将软管套牢；5、打开接种口靠罐阀门；500L种子罐接种操作

6、逐渐升高罐内压力至0.08Mpa，稳定后缓慢降低罐压（压力不能低于0.03Mpa），将种子液接入罐内；7、如一次不能接完，可重复⑥中的升压和降压，直至种子液全部接入罐内；8、关闭接种口靠罐阀；9、打开接种口排污阀门，卸清种子瓶内的压力，取下接种瓶，关闭接种口排污阀，旋上接种口外套；10、调节种子罐培养参数，开始培养。通过压差法或火焰接种法将摇瓶种子接种到种子罐中，温度37～37.5℃；罐压：0.05Mpa；通气量5.6m3/h；搅拌转速60rpm；通气量50L/min，培养过程中pH用20%的NaOH调节，维持6.8～7.0。培养时间12h~16h。种子罐培养（500L种子罐）

自接种起，按规定时间取样。具体为0h、5h、9h、10h、11h。取样时间根据菌体生长情况作一定调整。检查项目为还原糖、pH、镜检。光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中。无杂菌、菌体数量较多、残糖含量1.5～2.0g/L；周期约12h。在摇瓶和种子罐培养阶段，温度一般控制在37℃，或在不同的阶段采用不同的温度。在种子培养阶段和发酵初期，37℃培养可使菌体较快地生产增殖，发酵中期和后期可适当地降低温度，这样做可使葡萄糖的代谢方向由合成菌体细胞壁转向合成透明质酸，提高透明质酸的产率和相对分子质量。

等到种子罐内的种龄达到工艺要求，进行以下操作：1、关闭种子罐的出气阀门，使罐内的压力逐渐上升到0.10～0.12Mpa之间；2、关闭种子罐的取样排污阀和发酵罐的移种管道排污阀；3、将与移种相关的阀门打开，并关闭或切断与之无关的阀门；4、迅速同时打开发酵罐和种子罐的移种阀，将种子罐内合格的菌种移入发酵罐内达到工艺要求的菌种量；5、关闭发酵罐的移种阀。

四、5T发酵罐移种操作

1、培养条件温度：接种后36.8～37.0℃；10h后37.1～37.3℃；17h后37.5～37.8℃罐压：0.05Mpa通气量：接种后72m3/h；补料1h后90m3/h转速：接种后50rpm/min；补料1h后80rpm/minpH：培养过程中前期控制在6.9～7.0；补料后1h控制在6.9～8.0五、发酵培养（5吨）

综合pH及糖代谢情况决定是否放罐。当1min内pH下降低于0.02以下，糖浓度降低至3～5g/L（或糖不消耗，不加碱）时即可放罐。发酵周期作为参考依据。

六、放罐

发酵结束后，进入提取阶段。将发酵液移至干净的粗提罐内，加入95%的乙醇进行粗提。之后将粗提液移至一干净的罐内，加入纯水溶解，在搅拌下加入助滤剂以及活性炭，分别用NaOH和HCl进行大幅度地调整pH使蛋白质失活变性。然后过滤去除菌体、杂蛋白、重金属等杂质。滤液用95%的乙醇沉淀，沉淀物再用乙醇脱水，然后干燥得成品透明质酸。（注：干燥的温度在50℃～60℃，温度过高会影响透明质酸的生物活性，反之又会延长干燥的时间而浪费能源）。七、分离纯化核苷酸药物的提取制药目前，透明质酸的生产方法逐渐由动物组织提取法转向微生物发酵法。生物制药工艺课程真菌多糖的发酵制药真菌多糖

定义：指各种真菌的子实体和菌丝体所产生的一类代谢产物，具有某种独特生理活性的多糖化合物，包括酵母菌多糖、霉菌多糖、真核藻类多糖和大型真菌多糖等等。分类：1）结构多糖2）活性多糖生理功能：真菌多糖被称为称为“生物反应调节物”，简称“BRM”，经研究表明，多糖具有生物反应调节物的特征，可做为免疫增强剂和免疫激活剂，具有提高人体免疫功能、抗肿瘤、抗突变、抗衰老、降血糖、降血脂、预防糖尿病、抗菌和抗病等特殊生理功能。真菌活性多糖、真菌活性多糖的结构及生理功能二、真菌活性多糖的制备工艺真菌活性多糖的制备工艺原料有两种来源

子实体子实体多糖

液体深层发酵法

菌丝体

菌丝体多糖

（胞内多糖）

发酵液

发酵液多糖

（胞外多糖）

（一）真菌多糖深层发酵法

1．原理2．设备

3．工艺流程

真菌液体深层发酵工艺流程

操作注意：

1）摇瓶种子在室温下振荡培养4~6d后，经无菌检验以2%~5%的接种量接入种子罐中，发酵过程对无菌操作要求很高。

2）发酵前期通风比为1:0.5，中后期调至1:1。

3）培养过程采用搅拌方式。4．工艺说明（1）菌种：菌种培育→斜面或沙土管孢子低温保藏→复壮→分离纯化

（2）培养基：

①孢子培养基：提供菌体的生长繁殖，形成孢子。②斜面/液体种子培养基：供孢子发芽、生长和繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮，成为活力强的“种子”。③发酵培养基：供菌种生长、繁殖和合成产物（3）种子制备（种子扩大培养）①斜面活化：使保藏的生产菌种恢复活力②摇瓶培养：种龄要控制在对数期③种子罐扩大培养：一般不要超过三级（4）发酵罐：通风式发酵罐

（5）发酵过程工艺控制：

①温度、pH控制：最适生长温度和pH并非一定是最适产物形成温度和pH

②压力控制：正压发酵，保证纯种的培养

③溶解氧控制：通过通气和搅拌实现。搅拌转速，通气量发酵前期小、中期大、后期小④泡沫控制：食用级消泡剂如泡敌

⑤中间补料：真菌多糖的形成一般在减速期和稳定期，故在此时期内可连续或多次补料(一般为碳源)

⑥染菌控制：无菌操作，设备密封性能检查，染菌检查

（6）发酵终点判断：

何时放罐要根据发酵目的、经济等因素综合考虑。以菌丝形态、数量以及养分的消耗和代谢的变化作为指标。

（二）真菌活性多糖提取纯化工艺

1．原理：热水或极性溶剂浸提→分离纯化→胞内外多糖产品

2．设备

3．工艺流程

（1）原料及预处理：

4．工艺说明

（2）提取