曲师大酶工程课件

第二章酶的生物合成与发酵生产第二章酶的生物合成与发酵生产

提取分离法微生物细胞发酵产酶酶的生产方法生物合成法植物细胞发酵产酶化学合成法动物细胞发酵产酶

CompanyLogo第二章酶的生物合成与发酵生产酶生物合成及调节1细胞的选择及培养基的配制2产酶工艺条件及其调控3产酶的动力学4CompanyLogo第一节酶生物合成及调节遗传信息传递的中心法则蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNACompanyLogo一、酶的生物合成（一）RNA的生物合成--转录(transcription）

定义以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。（二）蛋白质的生物合成--翻译(translation）定义以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程CompanyLogo二、酶生物合成的调节（一）基因调控理论

JacobandMonod的操纵子学说（operontheory）

操纵子基因表达的协同单位结构基因（编码蛋白质structuralgeneS）操纵子操纵基因（operatorgeneO）控制部位启动子（promotorgeneP）CompanyLogo

调节基因

启动基因操纵基因结构基因

DNA

转录

（-）

RNA聚合酶（+）转录

翻译

mRNA

翻译

阻遏蛋白

蛋白质

诱导剂

控制区信息区操纵子基因操纵子调节系统示意图CompanyLogo调节基因(regulatorgene)：

可产生一种组成型调节蛋白(regulatoryprotein)

（一种变构蛋白），通过与效应物(effector)（包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。调节基因常位于调控区的上游启动基因（promotorgene）（启动子）：有两个位点：

（1）RNA聚合酶的结合位点（2）cAMP-CAP的结合位点。CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolitegeneactivatorprotein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMPreceptorprotein，CRP）。只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。

cAMP-CRP复合物的作用示意图

CompanyLogo操纵基因（Operatergene）:

位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。结构基因（Structuralgene）:

决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。CompanyLogo(二)酶合成调节的类型

1.诱导

(induction)

组成酶：细胞固有的酶类。诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。

2.阻遏

(repression)

分解代谢物阻遏(cataboliterepression)

反馈阻遏(feedbackrepression)CompanyLogo（三）酶合成的调节机制

1.酶合成的诱导加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。酶合成诱导的现象：已知分解利用乳糖的酶有：

-半乳糖苷酶；

-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；（2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；（3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成CompanyLogo调节基因操纵基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA阻遏蛋白（有活性）基因关闭启动子ORPLacZLacYLaca调节基因操纵基因乳糖结构基因启动子ORmRNAZmRNAYmRNAa阻遏蛋白（无活性）基因表达mRNAA、乳糖操纵子的结构

B、乳糖酶的诱导

乳糖阻遏蛋白（有活性）诱导CompanyLogo2.末端产物阻遏

由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。

酶合成阻遏的现象：

实验：

（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；

（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。CompanyLogo色氨酸操纵子——酶的阻遏调节基因操纵基因结构基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达调节基因操纵基因结构基因辅阻遏物代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基因不能表达CompanyLogo酶的诱导和阻遏操纵子模型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂操纵基因启动基因调节基因结构基因阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表达诱导物诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操纵基因结合,结构基因可以表达阻遏蛋白(无活性)酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达代谢产物CompanyLogo调控方式阻遏蛋白添加物与操纵基因结合阻遏效应举例酶的诱导有活性－＋不转录，继而不翻译诱导物－转录，继而翻译乳糖操纵子酶的阻遏无活性－阻遏物＋不转录，继而不翻译色氨酸操纵子酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比CompanyLogo3.分解代谢物阻遏指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。CompanyLogo分解代谢物阻遏现象：实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie或biphasicgrowth）。这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称降解物基因活化蛋白（CAP）。CompanyLogo分解代谢物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表达CAP基因结构基因TCAPOCAP结合部位

RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代谢产物腺苷酸环化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物与cAMP的关系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）降低cAMP浓度使CAP呈失活状态CompanyLogo三、提高酶产量的策略（一）菌种选育（一劳永逸）

1.诱变育种

(1)使诱导型变为组成型——选育组成型突变株(2)使阻遏型变为去阻遏型选育营养缺陷型突变株解除反馈阻遏选育结构类似物抗性突变株解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株

2.基因工程育种

CompanyLogo（二）条件控制1.添加诱导物酶的底物类似物最有效。2.降低阻遏物浓度

除去终产物产物阻遏添加阻止产物形成的抑制剂避免使用葡萄糖分解代谢物阻遏避免培养基过于丰富添加一定量的cAMPCompanyLogo3.添加表面活性剂

离子型对细胞有毒害作用表面活性剂Tween－80

非离子型增加细胞通透性

TritonX－1004.添加产酶促进剂CompanyLogo第二节细胞的选择基本原则：1、酶产量高2、容易培养和管理3、产酶稳定性好4、利于酶的分离纯化5、安全可靠现在大多数是微生物发酵生产，动植物细胞占少数CompanyLogo一、微生物常用的种类：

大肠杆菌（Escherichiacoli)

细菌

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)CompanyLogo放线菌：链霉菌（Streptomyces)

啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae)

酵母菌

假丝酵母（Candida)CompanyLogo

黑曲霉（Aspergillusniger)

米曲霉

(Aspergillusorzae)

青霉菌

(Penicillium)霉菌

木霉

(Trichoderma)

根霉

(Rhizopus)

毛霉

(Mucor)

红曲霉

(Monascus)CompanyLogo

产酶微生物的分离和筛选

1)样品的采集:从富含该酶作用底物的场所采集样品

2)富集培养:投其所好，取其所抗

3)分离获得微生物的纯培养（pureculture）。

4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。

5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。

CompanyLogo

-淀粉酶的筛选CompanyLogo蛋白酶产生菌的获得方法应用含酪蛋白的培养基CompanyLogo产酶微生物优良菌种的选育诱变育种原生质体融合育种基因工程育种CompanyLogo二、植物细胞

糖苷酶胡萝卜细胞－半乳糖甘酶紫苜蓿细胞漆酶假挪威槭细胞过氧化物酶甜菜细胞大豆细胞－葡萄糖苷酶利马豆细胞酸性转化酶甜菜细胞碱性转化酶甜菜细胞糖化酶甜菜细胞苯丙氨酸裂合酶花生细胞大豆细胞木瓜蛋白酶番木瓜细胞超氧化物歧化酶大蒜细胞菠萝蛋白酶菠萝细胞剑麻蛋白酶剑麻细胞木瓜凝乳蛋白酶番木瓜细胞CompanyLogo

人黑色素瘤细胞

中国仓鼠卵巢细胞（CHO)动物细胞

小鼠骨髓瘤细胞

牛内皮细胞CompanyLogo二、培养基的配制

碳源

氮源基本组分

无机盐

生长因子CompanyLogo二、微生物培养基碳源一般为淀粉及水解产物，氮源一般是无机氮源和有机氮源的混合物，无机盐和生长因子则根据需要添加，生产同一种酶，不同的地区、不同的企业中采用的培养基也有所不同，根据具体情况进行选择和优化CompanyLogo三、植物细胞1、植物细胞培养基特点：

(1)植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐。

(2)多种维生素。

(3)一般无机氮源。

(4)蔗糖碳源2％－5％。CompanyLogo2.几种常见培养基

MS培养基

B5培养基植物培养基

White培养基

KM-8P培养基CompanyLogo3.植物细胞培养基配制(1)大量元素母液(2)微量元素母液(3)铁盐母液(4)微生物母液

(5)植物激素母液CompanyLogo四、动物细胞培养基（一）组分1、氨基酸2、维生素3、无机盐4、葡萄糖5、激素6、生长因子CompanyLogo（二）动物细胞培养基的配制动物细胞培养基组分复杂，首先配制各种母液，一般是过滤除菌，冷冻保藏，使用时稀释。要确保各组分完全溶解，最好是现配现用。CompanyLogo第三节产酶工艺条件及其调控保藏细胞细胞活化细胞扩大培养原生质体固定化细胞产酶固定化原生质体预培养无菌空气培养基分离纯化酶CompanyLogo一、细胞活化与扩大培养

斜面保藏砂土管保藏保藏方法真空冷冻干燥保藏低温保藏石蜡油保藏培养时温度、pH、溶解氧应为最佳，培养到对数生长期，扩培时接种量为1%－10%CompanyLogo二、pH的调节控制

细菌：pH6.5－8.0不同细胞的pH

霉菌和酵母菌：pH4－6

植物细胞：pH5.2－5.8

动物细胞：pH7.2-7.6需要注意问题：产酶和生长最适pH有所不同，不同pH条件下，同一种细胞所产酶的比例也不同，由于细胞的繁殖和新陈代谢产物的积累，培养基的pH也会发生变化CompanyLogo调节的方法：1.改变培养基的组分或其比例。2.缓冲液来稳定。3.加入适量的稀酸、稀碱来调节。CompanyLogo三、温度的调节控制

细菌：34－37℃不同细胞的真菌：28－32℃生长温度

植物细胞：22－28℃

动物细胞：36－37℃注意的问题：最适产酶温度和最适生长温度有所不同，往往低于最适生长温度由于新陈代谢的作用，培养基温度会发生变化CompanyLogo采用的方法：1.热水升温2.冷水降温设计生物反应器的时候应该有足够的传热面积的热交换器，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等CompanyLogo四、溶解氧的调节控制溶解氧（solubleoxygen)是指溶解在培养基中的氧气，由于氧气难溶于培养基中，细胞很快就会利用完，因此需要不断得对培养基进行补充。细胞对溶解氧的需要量与细胞呼吸强度以及培养基中细胞浓度密切相关。一般用耗氧速率来表示Ko2。CompanyLogoKo2=Qo2.CCKo2为耗氧速率，指单位体积（L，mL）培养液在单位时间（h，min）内的耗氧量，（