基因工程-6-重组DNA构建与筛选

第二节重组DNA分子构建

一、粘末端DNA片段的连接（一）具有相同粘末端的连接EcoRIHindIIIEcoRI载体酶切HindIIIEcoRI对基因酶切（二）具有不同粘性末端的连接用两种不同的限制性内切酶对载体和外源DNA进行切割后，在它们两端会产生非互补的突出端，经DNA连接酶连接后即产生定向重组体。

HindIII二、平末端DNA片段的连接（一）直接用T4连接酶连接（二）同聚物加尾法优点：接“尾”后的载体不能自身环化，提高了转化效率。

缺点：①可能改变目的基因或载体的阅读框，影响外源DNA表达

②外源DNA无法收回

（三）衔接物连接法衔接物是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。（四）

DNA接头连接法

接头的一端是齐平的，而另一端是某种内切酶的粘性末端（五）

PCR引入酶切位点（六）

cDNA与载体的连接1.防止载体自身环化的措施

1、碱性磷酸酶脱磷酸基法

2、双酶切法

3、过量法：基因片段：载体（5:1or10:1)

2.影响连接的因素

1、基因片段大小小>大

2、基因与载体比例5:1-10:1

3、连接酶用量1u/ug载体DNA

4、连接温度16℃12小时

5、ATP用量

1mM（终浓度）三、重组DNA连接注意事项第三节基因转移一、重组DNA导入大肠杆菌

（一）转化

将外源DNA分子导入某一宿主细菌细胞的过程都叫转化。

为了有效地使细菌吸收外源的DNA分子，我们通常要对它们进行一些物理或化学的处理，处理后的细胞吸收外源DNA的能力大大提高，被称为感受态细胞。1、转化过程

E.coli：感受态细胞＋重组DNA分子加入LB扩增

涂布选择性平板

2、DNA分子转化受体细胞过程①吸收：DNA分子吸附于受体菌表面②转入：双链DNA分子解链，单链DNA进入，另一条链降解③自稳：进入细胞内的单链又复制成双链环状DNA④表达：目的基因随载体同时被复制，转录，翻译3、质粒DNA的大小及构型对转化效率的影响（1）大小＞10Kb，转化效率很低（2）构型超螺旋＞环形＞线状4、感受态细胞能接受外来DNA分子的本质：

4.1局部原生质体化假说细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进细胞。证据有：

（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；

（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA转化；

（3）适量的溶菌酶能提高转化率。

4.2酶受体假说感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；

（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；

（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。（二）转染（2）λ噬菌体的体外包装转染(transfection)：是指感受态的受体细胞捕获和表达以噬菌体为载体的重组DNA分子的过程。（1）转导和转染的区别转导(transduction)：通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA转移到受体细胞的过程。转染：λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程。

（三）电激法(electroperation)

电激法是利用高压电脉冲的作用对原生质体或细胞击出微孔而使基因转移的一种新方法。可逆击穿：击穿小孔可在一定时间内复原。不可逆击穿：击穿小孔不可修复，处理细胞成活率低。1.电转化流程（1）电转化感受态细胞的制备（2）电转化操作程序电击复苏涂布（3）电击杯清洗二、重组DNA导入植物细胞的方法

（一）载体介导的转化方法

1、共培养法(cocultivation)

（1）原生质体共培养法

取含重组Ti质粒的农杆菌同刚刚长出细胞壁的原生质体作短暂的共培养，促使农杆菌和植物细胞之间发生遗传物质的转化。（2）叶盘共培养法

优点：适用性广，对于那些能被农杆菌感染的、并能从叶子再生植株的各种植物均适用。2、活体接种(inoculationinvivo)

（二）病毒介导的基因转移

（1）双链DNA病毒转化载体

花椰菜花叶病毒（简称CaMV,CaullinusMozicVirus）。

（2）单链DNA病毒转化载体

双联体病毒或孪生病毒感染范围较广，包括单子叶和双子叶植物，它们的传播媒介是昆虫。

（4）激光微束法(lasermicrobeam)

（5）超声波法

（6）离子束法（3）电激法(electroperation)（2）微注射法（micro-injection）（三）DNA直接导入法

（1）基因枪法1、物理方法

（1）基因枪法

80年代末期，由康奈尔大学的Sanford最先提出，主要是为了克服以往各种基因转化技术的局限。该方法是利用一种物理仪器装置，将钨、金等金属微粒加速冲击细胞，把细胞击孔，使目的基因进入受体。

基因枪所用材料：（1）钨粉使用起来经济实惠，也可以得到较好的转化效果；但容易被氧化，颗粒易聚集，并且对植物细胞的毒害也比金粉大。（2）将DNA包被到微载体上所用的试剂有亚精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇、异丙醇等，但多用前两种。（3）所用动力系统：火药爆炸力电弧放电高压气体基因枪法的特点：（1）转化效率高。（2）受体广泛。（3）操作简单。（2）微注射法（micro-injection）

微量注射：用注射针或微针在受体细胞或组织穿刺成孔，DNA随穿刺孔进入细胞或随穿刺针头—道进入。

显微注射：利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法。常用的细胞固定方法有3种：一、琼脂糖包埋法二、多聚赖氨酸粘连法三、吸管支持法（3）花粉管道法（2）脂质体法（三）DNA直接导入法

（1）PEG法1、化学方法

（3）花粉管通道法（pollen-tubepathway）

在显花植物中利用花粉在柱头上萌发进入胚囊所留下的通道，将外源基因渗入到胚囊中的基因直接转移方法。（2）DEAE-葡萄糖转染技术

（3）电穿孔转染技术

（4）脂质体载体法（5）细胞核的显微注射法

三、重组DNA导入动物细胞的方法

（1）磷酸钙转染技术

（6）活体电穿孔技术

活体电穿孔法(invivoelectroporation)是将外源基因通过电场作用，导入动物目标组织或器官。活体电穿孔法的特点：靶器官的选择面广对导入的外源基因片段的大小没有限制,从几KB或十几KB的表达载体,到100～200KB的YAC、BAC基因组,都有成功导入并获得表达的报道。活体电穿孔法操作简单快速,电穿孔的时间只有几秒钟,而且DNA片段不需要特殊的纯化操作。研究实例一杀蚊毒素在大肠杆菌中的异源表达Thetoxiniscomposedoftwoproteins,BinAandBinB,withapproximatemolecularweightsof42and51kDa,respectively.Thetwoproteinsrequireeachotherforfullactivity,andmaximumactivityisobtainedwhenbothcomponentsarepresentinequimolarratio.1.背景介绍2.外源基因的获得PCR引物：BinABS51F;5’-CGA

AGC

TTGTGCGATTCAAAAGACAAT-3’BS51R;5’-CCT

CGA

GAATGAATATTTGAATTTAAAGAG-3’BinBBS42F;5’-GAA

GCT

TGAGAAATTTGGATTTTATTGATT-3’BS42R;5’-GGCGGT

CGA

CTTAGTTTTGATCATCTGTAATA-3’Therestrictionsitesaddedatthe5’endoftheseprimers(HindIIIinBS42FandBS51F,SalIinBS42R,andXhoIinBS51R)areunderlined.GenesencodingBinAandBinBwereamplifiedfromplasmidpET-42fandpET-51fFigSchematicdiagramofpGEX-BinAandpGEX-BinB.Polymerasechainreaction(PCR)productsofbinAandbinBgenesweredigestedwithHindIIIatthe5’endandmadebluntendedusingKlenowpolymerase.The3’endofbinAwasdigestedwithSalI,whereasXhoIwasusedforbinB.ThedigestedfragmentsthenwereligatedtopGEX-4T-2betweenSmaIandXhoIsites.2.重组DNA构建3.重组子筛选与表达EscherichiacoliJM109containingpGEX-BinAorpGEXBinBwasgrowninLuria-Bertani(LB)brothcontaining100lgofampicillin/mluntilOD600reached0.4.Toinduceproductionofthetoxin,1mmol/lisopropyl-b-D-thiogalactopyranoside(IPTG)wasadded,andtheculturewasfurthergrownfor5h.Theinducedculturethenwascollectedandanalyzedbysodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis(SDS).4.表达产物活性测试第四节重组DNA分子的筛选外源基因与载体连接后转化大肠杆菌可能的三种情况：（1）（2）（3）转化E.coli一、重组体的筛选遗传检测方法抗药性标记插入失活β-半乳糖苷酶显色反应插入序列表型特征免疫化学方法

免疫沉淀法放射性抗体检测核酸杂交方法转译筛选法（一）遗传检测方法

原理：

根据载体DNA分子上的筛选标记赋予受体细胞在筛选平板

上表型的变化。如抗药性引起生长与不长；颜色变化等。

方法：

①插入失活抗生素平板筛选法（pBR322系统）

由于外源DNA的插入引起抗药性失活——插入失活插入失活-环丝氨酸筛选法四环素+环丝氨酸氨苄青霉素②插入不分泌奶粉平板筛选法（B.SpNC3系统）

由于外源基因的插入而影响蛋白酶的分泌无外源DNA插入当插入外源DNA时当DNA不插入时NprE表达分泌溶解酪蛋白产生透明圈当DNA插入时NprE不表达不分泌不溶解酪蛋白不产生透明圈

③显色平板筛选法（pUC系统)

④插入序列表型特征(二)免疫化学筛选法

原理

以目的基因在受体细胞中的表达产物作抗原，

以动物制备抗体，通过抗原抗体反应而将带有目

的基因的克隆筛选出来。

方法

①免疫沉淀法

适应于：高表达；外分泌克隆筛选

克隆沉淀线含抗体平板②放射免疫筛选法

1.放射免疫筛选过程

A、制备抗原：培养菌落

（噬菌斑）

B、制备抗体：免疫动物

C、抗原抗体反应

D、检测：放射自显影

E、选出重组体2.放射免疫筛选法优点：

①可以选出无表型特征的克隆

②可以选出表达融合蛋白的基因克隆

3.放射免疫筛选法缺点：

①必须是表达载体

②需要放射性物质——同位素：污染昂贵

(三)核酸杂交方法探针（probe）：用来探知被测物存在的小分子DNA