真菌6-脂肪酸脱氢酶基因459bp的克隆及异源表达

真菌6-脂肪酸脱氢酶基因459bp的克隆及异源表达

作为人体的必要脂肪酸，它被认为是重要的生理活性物质的前列腺素pg-i和pg-ii的前体，在调节人体激素和脂肪酸代谢方面发挥着重要作用。γ-亚麻酸是通过Δ6-脂肪酸脱氢酶将亚油酸的第六位碳原子脱氢转化形成的,因此,Δ6-脂肪酸脱氢酶是γ-亚麻酸生产中的关键酶,并成为国内外学者的研究热点。自九十年代初期由美国的Reddy等人首次报道了产生γ-亚麻酸的单细胞兰细菌(Synechocystissp.)PCC6803分离出Δ6-脂肪酸脱氢酶基因,并在另一株不产生γ-亚麻酸的兰细菌(Anabaenasp.)中成功表达以来,先后从植物琉璃苣,丝状真菌高山被孢霉,线虫等克隆到了该基因,并在酿酒酵母和烟草中进行了表达。2000年,Sperling等报道从苔藓(Ceratodonpurpureus)中克隆到具有双重功能的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因,不仅可以在亚油酸C6上脱氢形成亚麻酸,而且可以在该位置上继续脱氢,形成一个炔键。2003年Y.Michinaka报道了在卷枝毛霉中克隆到两个Δ6-脂肪酸脱氢酶同工酶基因,而且在低温下表达量存在明显差异。雅致枝霉是一种可以在低温条件下生长的毛霉目低等丝状真菌,Manocha等报道在低温诱导下雅致枝霉不仅产生γ-亚麻酸还可产生α-亚麻酸,这在低等丝状真菌是首次发现,因此克隆和分析雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因,对研究低温诱导不饱和脂肪酸合成的调节具有重要的意义。本文采用RT-PCR及RACE方法得到一段1504bp的全长cDNA序列。对长度为1377bp的开放阅读框架进行了功能性表达。这是国际上首次从雅致枝霉克隆到Δ6-脂肪酸脱氢酶基因并在酿酒酵母中进行功能性验证的报道。1材料和方法1.1材料表面1.1.1质粒载体pgem-t雅致枝霉(ThamnidiumelegansAs3.2806)、购于中国科学院微生物研究所;大肠杆菌(EscherichiacoliDH5α)由本实验室保藏;质粒载体pGEM-T购自Promega公司;酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeINVSc1)营养缺陷型及表达载体pYES2.0购自Invitrogen公司。1.1.2聚合酶、内酰胺酶及聚合酶所有DNA分子量标准、DNA限制性内切酶购自TaKaRa公司,X-Gal、IPTG、TaqDNA聚合酶购自北京鼎国生物公司,氨苄青霉素、NP-40及亚油酸购自Sangon公司,脂肪酸甲酯标准品购自Sigma公司,反转录试剂盒和pGEM-T载体为Promega公司产品,SMRTTMRACEcDNAAmplificationKit为Clontech公司产品。气相色谱仪为岛津GC-7A。1.1.3培养树霉pda培养基大肠杆菌LB培养基,见文献,雅致枝霉PDA培养基,见文献酵母营养缺陷型按Invitrogen公司操作手册进行,诱导表达的培养基按文献。1.1.4引用的合成和测量顺序引物合成由北京奥科公司完成,引物序列及用途(表1)。测序均由上海生工完成。1.2-amv-cl2的合成按上海生工的UNIQ-10TRIzol总RNA提取试剂盒方法,从液体培养36h的雅致枝霉中抽滤获得菌丝体然后液氮研磨提取总RNA。按反转录试剂盒要求,取1μg总RNA为模板,Oligo(dT)15为反转录引物,70℃变性10min,冰浴5min,然后分别加入,5μL10×RTbuffer,2μLMgCl2(25mmol/L),0.5μLasinRNain(40U/μL),0.5μLAMV(20U/μL),加水补至20μL,42℃反应1h,95℃加热10min终止反应,合成第一条cDNA,-20℃备用。根据已报道深黄被孢霉(Mortierellaalpina),卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)、畸雌腐霉(Pythiumirregulare)、少根根霉(Rhizopusarrhizus)的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因同源序列组氨酸保守区HisII(WWKNKHNTHH)和另一氨基酸保守区的氨基酸序列(HNGMPV)设计简并引物P1和P2,取2μLcDNA进行PCR。扩增条件:94℃变性3min;94℃1min,37℃2min,72℃1min,5个循环;94℃1min,57℃2min,72℃1.5min,30个循环;72℃10min。将PCR产物回收并克隆到pGEM-T载体上,转化E.coliDH5α,蓝白斑筛选和酶切鉴定阳性克隆,挑选正确的阳性克隆测序。1.3整个hda的扩展1.3.1生物基因型pcr检测以P5作为反转录引物,按上述方法反转录合成第一条cDNA。根据已获得的部分cDNA序列设计基因特异性引物P3与3′RACE下游引物P4进行3′cDNA末端扩增,条件94℃变性3min;94℃1min,57℃1min,72℃1min,30个循环,72℃10min。将PCR产物回收并克隆到pGEM-T载体上,挑选正确的阳性克隆测序。1.3.2合成相关cdna按SMRTTMRACEcDNAAmplificationKit要求,取1μg总RNA为模板,合成第一条cDNA,以P7和特异性引物P6进行5′cDNA末端的扩增。条件为94℃变性3min,然后按94℃1min,60℃1min,72℃2min,30个循环;72℃10min。将PCR产物回收并克隆到pGEM-T载体上,挑选正确的阳性克隆测序。1.3.3序列拼接将部分cDNA序列和3′和5′RACE获得的序列用DNAMANVersion4.0进行序列拼接,结合测序峰图进行序列校正,最后获得拼接好的序列。1.3.4构建质粒ptted6根据序列拼接结果设计两端引物P8和P9,按94℃1min,58℃1min,72℃2min,30个循环,将PCR产物回收并克隆到pGEM-T载体上构建质粒pTTED6。引物P8和P9中黑体表示在5′和3′端引入的酶切位点KpnⅠ、EcoRⅠ。1.4质粒双酶切法制备ndf提取的含有雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的质粒pTTED6,用KpnⅠ、EcoRⅠ双酶切,回收并与以同样双酶切的质粒pYES2.0连接,构建得到新质粒pYTED6(图1),并转化到大肠杆菌DH5α,以Amp+筛选阳性转化子,提取质粒pYTED6冻存-20℃备用。1.5酒刑事捐赠者1.5.1酒窝反应的制备和转化按文献方法进行操作。1.5.2酒刑事酶诱导按文献方法进行操作。1.6母字母菌的脂肪酸甲化按文献方法进行。1.7脂肪酸甲酯化物的合成柱子:弹性石英毛细管柱,0.32×30m,固相支持物:聚二乙二醇丁二酸酯(Poly-diethyleneglycolsuccinate,DEGS)镀膜物:聚酰亚胺。载气:N2,线速:10cm/s。分流比∶100∶1,气化室温度:250℃,柱温:180℃,尾吹:50mL/min,检测器:氢火焰离子化检测器。以Sigma公司生产的GLA甲酯为标准品,上海生工公司产LA甲酯化后为底物对照。把上述方法制备的脂肪酸甲酯化的样品,进行GC分析,上样量为1μL。分析软件:ANSTAR,分析之星色谱工作站。2结果2.1基于生物活性的race扩增多态性根据已报道的深黄被孢霉、卷枝毛霉、畸雌腐霉、少根根霉的Δ6-脂肪酸脱氢酶同源序列中保守的组氨酸富集区II(WWKNKHNT)和同源性较高的区域(HNGMPV)的氨基酸序列设计简并引物进行RT-PCR,获得长度约为500bp的片段。将片段回收后,测序结果显示所扩增得到的片段全长为459bp,编码153个氨基酸。通过其编码的氨基酸序列在GenBank数据库中用BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)进行相似性搜索,结果显示该cDNA所编码的氨基酸序列和所搜索得到的序列的相同性在29%～65%,表明已获得的cDNA序列可能是编码Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的部分序列。在获得部分cDNA序列的基础上,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术进行两个末端序列的扩增。根据所获得的部分cDNA序列设计基因特异性引物,进行3′和5′cDNA末端扩增,结果分别获得约500bp和800bp的片段,测序分析结果显示,3′cDNA末端扩增获得长度为499bp的序列信息,包括22bp的PolyA尾,其和已获得的部分cDNA序列之间存在104bp的重叠区,即在后者下游延伸出395bp的末端序列。两个片段拼接所得到的序列在转译分析中能形成编码254个氨基酸通读序列,并在PolyA尾上游的第42bp处因存在一个TAA而中断,在编码的氨基酸序列中发现存在QIEHHVFP序列,和上述真菌来源的Δ6-脂肪酸脱氢酶的组氨酸富集区Ⅲ的序列QIEHHLFP基本相同,表明两者属于同一cDNA片段。同样,5′cDNA末端扩增获得长度为785bp的序列信息,其与已知部分cDNA序列存在74bp的重叠区,即在部分cDNA序列上游延伸出711bp,两个片段拼接的序列转译分析中也获得了通读的编码359个氨基酸序列,而且存在HDFGHH和WWKNKHNTHH的两个组氨酸富集区,与上述已报道脱氢酶中对应序列相似,这也表明5′RACE扩增片段与上述两个扩增片段属于同一cDNA。因此,经上述3个步骤的扩增,用序列分析软件将3个片段进行拼接,得到全长为1504bp的核苷酸序列信息(GenBank,AY941161)。2.2-脂肪酸脱氢酶氨基酸序列的鉴定及与分析通过分析软件进行的序列分析结果表明,在1504bp的cDNA序列中存在一个潜在的开放阅读框,位于5′末端下游36～1413bp之间,全长为1377bp,编码459个氨基酸、分子量为52.4kDa的蛋白和其它已报道的Δ6-脂肪酸脱氢酶氨基酸序列特别是真菌来源的相比较,并从编码蛋白的分子量和序列长度分析,有可能编码一个完整的Δ6-脂肪酸脱氢酶,命名为TED6。ORF两侧为36bp的5′非转译区和91bp的3′非转译区,而且,在3′末端的polyA尾上游56bp有一个加尾信号aataaa,进一步表明所获得片段包含全长的mRNA3′非转译区。将所推测的氨基酸序列和已报道真菌的Δ6-脂肪酸脱氢酶氨基酸序列相似性分析表明,该序列和少根根霉、卷枝毛霉、高山被孢霉、深黄被孢霉和畸雌腐霉的Δ6-脂肪酸脱氢酶氨基酸序列具有较大同源性,相同性分别为:87.6%、56.4%、48.8%和48.8%、37.2%。通过氨基酸序列分析结果显示在其N端有细胞色素b5区HPGG氨基酸位点49-52,氨基酸序列的174～179、211～215和395～399位点具有膜整合酶特异性保守的3个组氨酸富集区HDFGHH(HisI)、HNTHH(HisII)和QIEHH(HisⅢ),其中HisⅢ中组氨酸H被谷氨酰胺Q取代和其它真核生物中的Δ6-脂肪酸脱氢酶相同。2.3酵母菌细胞的脂肪酸为了验证TED6的功能,用重组表达质粒pYTED6(图1)转化酵母细胞,获得转基因酵母工程菌株YTED6,经半乳糖诱导后,提取转基因酵母细胞的总脂肪酸。脂肪酸经甲酯化后,以γ-亚麻酸甲酯标准品、受体菌INVScl、空载体pYES2.0转化的酵母菌细胞作为对照进行GC分析(图2-A)。结果只有酵母工程菌株YTED6产生保留时间为14.95min的特殊峰(图2-B中黑色箭头所示),与GLA甲酯标准品的保留时间14.92min相对应,而在空载体和空菌体的对照样中没有出现相应的峰。GLA含量占细胞总脂肪酸含量的7.5%(表2)。2.4gla甲酯衍生物为了进一步确证所出现的新峰为GLA甲酯,经GC-MS定性分析,然后通过NIST/EPA/NIH数据库的计算机检索,结果显示特殊峰为GLA甲酯(图3-A),m/z=292表示GLA甲酯化衍生物的分子量,与GLA甲酯标准物(图3-B)的相同,这些结果表明TED6的编码产物能催化外源性亚油酸转化成GLA,具有Δ6-脂肪酸脱氢酶的功能。3讨论3.1白超家族氨基酸疏水性变化Δ6-脂肪酸脱氢酶是PUFAs代谢途径中的限速酶,它也是一种膜整合的脂肪酸脱氢酶,具有特征性的3个保守的组氨酸富集区和细胞色素b5区,目前这些结构特征已成为Δ6-脂肪酸脱氢酶基因克隆的主要依据。真核生物中的Δ6-脂肪酸脱氢酶是一种定位于微体膜的“front-end”脂肪酸脱氢酶,属于Cytb5融合蛋白超家族,其特点就是除了3个保守的组氨酸富集区外,在氨基酸序列中具有细胞色素b5区的结构HPGG。细胞色素b5区的存在表明脂肪酸脱氢酶定位于微体膜上,而不是质体中,因为质体中的脂肪酸脱氢酶一般只利用铁氧还蛋白作为电子供体。通过Δ9和Δ6-脂肪酸脱氢酶中突变分析证明HPGG起到电子供体的功能,是维持酶活性所必需的。在所获得cDNA序列所编码的氨基酸序列中存在上述3个保守的组氨酸富集区,其N端也具有类似于细胞色素b5区的结构HPGG,表明所编码蛋白也是一种“front-end”脂肪酸脱氢酶。采用Kyte-Doolittle方法进行氨基酸疏水性分析(Hydropathyprofile)结果也表明和已报道的Δ6-脂肪酸脱氢酶一样,所推测的氨基酸序列存在两个长的具有膜整合蛋白特征的疏水结构。如图4横线条所示,第1个疏水区位于细胞色素b5区和第1个组氨酸富集区之间,第2个疏水区则位于第2个和第3个组氨酸富集区之间,疏水区形成四次跨膜结构。以上结果说明所获得的cDNA序列编码一个潜在的Δ6-脂肪酸脱氢酶。3.2gla和gla在6-脂肪酸脱氢酶中的表达经过上述的基因克隆、序列分析,我们初步推测从雅致枝霉中获得